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在保证原有基因氨基酸序列不变的基础上,根据水稻密码子的偏好性及使用频率,优化、改造crylCa基因,提高6C含量,去除影响mRNA结构不稳定因素的序列,在crylCa基因前后增加有利于在植物中表达的前导序列和终止识别序列,以BamHI酶切位点添加于基因的两端等,最终合成全长为1912bp基因序列。
构建crylCa基因的原核表达载体PET-28bca,通过IPTG诱导进行大肠杆菌融合蛋白表达和包涵体纯化,利用融合蛋白带有6个组氨酸标签的特点采用金属Ni离子螯和亲和层析对变性溶解的融合蛋白进行纯化获得大小为67KDa的目的蛋白。经复性后免疫新西兰大白兔,获得高特异性且效价为1:10000的多克隆抗体。
构建crylCa基因的双T-DNA植物表达载体pCDMARCA,农杆菌转化水稻籼稻明恢86,经Southern blot杂交分析表明crylCa基因已整合入水稻染色体基因组,ELISA的结果也表明目的基因已在水稻叶片中表达,表达量占叶片总可溶性蛋白的0.01-0.28%。结合田间自然条件下的抗虫性调查,最终获得33份抗虫转crylCa基因T0代材料。