二甲基亚砜在重组CHO细胞培养生产乙肝表面抗原中的作用

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本文研究了二甲基亚砜(DMSO)在重组CHO细胞培养生产乙肝表面抗原(HBsAg)的作用。实验发现,培养基中添加1.5%DMSO使CHO细胞的HBsAg产量提高了80%以上,比生产速率提高了5倍多。DMSO的添加抑制了CHO细胞的生长,当DMSO浓度超过1.5%时,细胞最终生长密度低于对照组的50%。在0~1.5%DMSO范围内,HBsAg的表达量随着DMSO浓度的增加而提高。DMSO添加无论是HBsAg产量还是比生产速率的提高有一个明显的约48h的适应期,随后HBsAg的产量和比生产速率快速提高。DMSO引起了HBsAg在细胞胞内的大量积累,胞内HBsAg的浓度达到了982mg/L,为对照组的9倍多。实验证明DMSO最佳添加时机为细胞指数生长后期。 DMSO对重组CHO细胞的代谢影响很大,葡萄糖、谷氨酰胺和消耗性氨基酸等营养物的消耗降低,代谢副产物乳酸、氨、丙氨酸和甘氨酸生成量大大减少。DMSO添加使葡萄糖的消耗量降低了40%以上。同时DMSO降低了葡萄糖的比消耗速率,提高了细胞对葡萄糖的得率系数。DMSO使乳酸的比生产速率降低了27%,从对照组的9.40mmol/106cells/day降低到处理组的6.86mmol/106cells/day。DMSO添加减少了CHO细胞对氨的累积。添加DMSO后,胱氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等消耗性氨基酸的消耗量增加,谷氨酸和赖氨酸从消耗性氨基酸变为积累性氨基酸。 对CHO细胞生理形态的观察发现,DMSO影响了细胞的生长形态,细胞多层生长现象明显减少,特别是当浓度高于1.0%时,细胞表现出了上皮细胞典型的单层生长行为。但DMSO浓度高于2.0%时,细胞生长形态明显改变,出现细胞脱落、变圆现象。细胞周期分布的流式细胞仪分析表明,DMSO使CHO细胞在G1期捕获,G1期细胞分布比例从对照组57.7%提高到1.5%培养组的68.3%。DMSO处理对细胞膜通透性改变没有明显影响。 DMSO引起了CHO细胞蛋白质组的变化。参与细胞中DNA和mRNA复制和转录的锌指蛋白和核内异质核糖核蛋白Hnmp是DMSO正调控的。与葡萄糖酵解相关的酶,醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶和烯醇酶等五种酶是DMSO负调控的。分子伴侣蛋白,如热激蛋白HSP70和ERP57蛋白,蛋白二硫键异构酶(PDI)和肽基脯氨酸顺反异构酶表达均是DMSO下调的。细胞色素cytochromeb5是DMSO上调的。 在生物反应器微载体培养时,DMSO提高了HBsAg的生产水平,降低了细胞对营养物的消耗。DMSO在微载体培养反应器中对细胞生长的抑制作用更加显著。固定床生物反应器培养证明了实验所选择的无纺布固定床填料对于贴壁依赖性细胞的生长有良好的兼容性,床层里的细胞密度估计达到了5.2×107cells/ml。但是DMSO在固定床培养时对提高HBsAg生产的作用并没有分批培养明显。
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