论文部分内容阅读
种子休眠是植物适应多变自然环境的一个重要生物学特性。对农作物而言，由于休眠能够直接影响其产量、种子品质以及农业生产和应用，因此受到遗传和育种学家的广泛关注。对模式植物拟南芥种子休眠调控方面的研究，已发现休眠调控网络的框架结构。然而到目前为止，对单子叶植物水稻种子休眠机制的了解仍知之甚少。因此，深入研究水稻种子的休眠机制，对于提高粮食产量和品质具有极其重要的实际意义。 AGL17-1ike亚家族的基因主要在营养器官中表达，水稻中该亚家族共有5个成员，分别是OsMADS23、OsMADS25、OsMADS27、OsMADS57和OsMADS61。目前仅有对OsMADS57功能研究的报导，而对于该亚家族中其余成员的研究则鲜有报道。OsMADS57在叶中表达量最高，参与水稻分蘖数的调节。本论文主要对与OsMADS57进化关系最近的基因OsMADS27进行功能研究。 首先，我们获得了OsMADS27的两个敲除突变体，对其表型进行观察，发现二者均表现出种子萌发延迟的表型。为了确定该表型是否是由于OsMADS27功能缺失所致，我们分别获得了OsMADS27的RNAi转基因株系和突变体转基因组互补株系。结果发现前者也具有种子萌发延迟的表型，而后者恢复了突变体的表型，由此确定OsMADS27与突变体表型具有直接的关系。 为了深入探讨OsMADS27的生物学功能，我们利用原位杂交和RT-PCR(reverse transcription PCR)的方法对其表达模式进行分析，结果显示OsMADS27主要在根和发育的胚中表达，在其它部位有微弱表达。另外，已有文献报道OsMADS27是miR444b.2的靶基因，因此我们构建并获得miR444b.2的过量表达转基因株系，结果显示OsMADS27的表达下调并且出现种子萌发延迟的表型，表明miR444b.2通过负调控OsMADS27的表达参与了种子的萌发过程。 为了进一步研究OsMADS27突变体种子萌发延迟可能的作用机制，我们比较了野生型和突变体在含GA或ABA培养基上的萌发情况，发现突变体对ABA过敏感，而对GA的响应正常，初步确定突变体的表型可能与ABA有关。ABA含量测定结果显示，突变体种子中ABA含量高于野生型。因此，我们初步确定OsMADS27突变体种子萌发延迟是由于ABA含量升高造成的。 为了进一步探究突变体ABA含量升高的原因以及发生时期，对不同发育阶段种子内的ABA含量进行测定，结果显示野生型和突变体中ABA含量产生差异的时期与OsMADS27的表达时期基本一致，即起始于受精后8天，一直持续至种子成熟。通过对此阶段中ABA合成的关键基因NCED1/2/3/4/5的表达情况进行检测，我们发现突变体中只有NCED1的表达量持续高于野生型，所以初步认定NCED1可能是OsMADS27的靶基因。EMSA(Electrophoretic MobilityShift Assay)结合实验、转录活性检测以及LUC(Luciferace)活性实验确定OsMADS27可以直接抑制NCED1的表达。以上结果说明，突变体内OsMADS27功能缺失，导致NCED1的表达上调，使种子内ABA的含量增加。 此外，前人的研究发现种子内ABA的含量与休眠程度密切相关。因此，我们对野生型和突变体的种子进行了休眠实验，发现突变体的休眠增强，基因组互补转基因株系可以恢复这一表型。种子的休眠和萌发是连续的过程，种子的休眠程度直接影响到之后的萌发过程。此结果表明，最初观察到的突变体种子萌发延迟的表型是由休眠增强所致。 综上所述，本课题研究发现:OsMADS27自身在转录后水平受到miR444b.2的负调控，同时也负调控其下游靶基因NCED1的表达;OsMADS27功能缺失导致其突变体种子内ABA的含量增加，最终造成休眠增强、萌发延迟的表型。上述发现初步揭示了单子叶植物水稻种子休眠的分子调控机制，为休眠机理的研究提供了新线索，也为进一步探究AGL17-like亚家族的基因功能奠定了基础。