论文部分内容阅读
目的:本研究病-证结合，将健康人感染HBV发展至肝癌的疾病过程和慢性肝病三个典型证候（肝胆湿热，肝郁脾虚和肝肾阴虚）作为两个研究切入点，探讨慢性肝病发展过程机制，证候物质基础以及证候“实-虚”动态变化的关系机制。 方法:收集HBV感染引起的慢性肝病患者血液标本，采用转录组学及蛋白组学方法，分别检测mRNA转录组学和蛋白组学数据。首先，通过生物信息学分析方法，深入挖掘数据，构建疾病或典型证候相关动态生物分子网络，寻找慢性肝病“疾病”、“证候”以及“病-证”相关潜在分子标志物;然后收集慢性肝病相关患者（包含三个典型证候及隐证）血液样本，采用分子生物学技术对上述部分潜在分子标志物进行验证。最后综合数据，采用动态数据的生物信息学方法探讨慢性肝病发展过程及证候由“实-虚”动态变化的关系机制。 结果:(1)通过基因共表达网络分析，TGFβ1，IFI30，HLA-DMA，PAG1对慢乙肝和乙肝后肝硬化具有较高的分辨率及诊断精度;KLF11，GOLPH3，SORT1和CD209可能是能够分辨乙肝后肝硬化和肝癌的潜在分子标志物。通过差异蛋白分析，PLG，IGFALS，IGFBP3，LCAT，SERPINA5和ITIH4能够区分慢乙肝和乙肝后肝硬化;HPX，HPR和C2能够区分乙肝后肝硬化和肝癌;细胞因子IL-9，GM-CSF和IL-2Rα及上述基因的Logistic回归模型对慢乙肝-乙肝后肝硬化具有较高的分辨率及诊断精度。 (2)肝胆湿热证与肝郁脾虚证的基因共表达网络分析:乙肝后肝硬化中PNP，AQP7和PSMD2;肝癌中ITGA2，RUNX1T1和NRP2在两个证候共表达网络中共表达地位变化大，可能具有重要调控作用。肝胆湿热证与肝肾阴虚证的共表达网络分析:慢乙肝中的HIF1A，HDAC9和NR3C1;乙肝后肝硬化中PIM2，SHARPIN和FGB;肝癌中FA2H和CXADR在两个证候共表达网络中共表达地位变化大，可能具有重要调控作用。肝郁脾虚证与肝肾阴虚证的共表达网络分析:慢乙肝中G6PD，SMAD7，TAP2和TNF;乙肝后肝硬化中RBM3，TGFBI和PARK7在两个证候共表达网络中共表达地位变化大，可能具有重要调控作用;肝癌中CRIP1，APOF和ORM1在两个证候共表达网络中共表达地位变化大，可能具有重要调控作用。慢乙肝典型证候差异蛋白分析中，CFH能够很好的区分肝胆湿热证与隐证组，PEDF也有潜在的可能区分肝郁脾虚证和隐证组。IL-17，MIP-1α和MIP-1β及三者的结合能够区分乙肝典型的肝胆湿热证和肝肾阴虚证。IP-10，IL-18及其结合的Logistic回归模型能够区分乙肝后肝硬化的肝胆湿热证和肝郁脾虚证。 (3)健康人感染HBV至形成肝癌基因表达趋势分柝COL5A1，CDK4, MMP2,SCD四个基因在健康人感染HBV至形成肝癌过程中具有重要调控作用。健康人感染HBV至形成肝癌蛋白表达动态分析: F2，PLG，SERPINA5和C3可能是这一疾病发展过程中重要的调控蛋白。慢性肝病典型证候“实（肝胆湿热）-虚实夹杂（肝郁脾虚）-虚（肝肾阴虚）”基因动态表达趋势分析:COX5A，EIF2B2，EIF5B，MIOX和XPO1可能在这一动态变化过程中扮演重要角色。 结论:(1)通过HBV感染性慢性肝病的转录组和蛋白组分析，找到一组基因，蛋白能够分辨慢乙肝和乙肝后肝硬化，或者乙肝后肝硬化和肝癌。通过对部分分析结果进行mRNA实验和ELISA实验证实:TGFβ1，IFI30，HLA-DMA，PAG1对慢乙肝和乙肝后肝硬化具有较高的分辨率及诊断精度;细胞因子IL-9，GM-CSF和IL-2Rα及上述基因的Logistic回归模型对慢乙肝-乙肝后肝硬化具有较高的分辨率及诊断精度。 (2)通过HBV感染性慢性肝病典型证候的转录组和蛋白组分析，慢性肝病典型证候之间存在转录组学和蛋白组学的差异表达。通过构建基因共表达网络，发现一组基因在各个证候共表达网络中具有重要调控作用。通过对部分分析结果进行mRNA实验和蛋白芯片实验证实:PNP，AQP7和PSMD2可以分别乙肝后肝硬化的肝胆湿热证和肝郁脾虚证。IL-17，MIP-1α和MIP-1β及三者的结合可以分辨慢乙肝肝胆湿热证和肝肾阴虚证。IP-10，IL-18及其结合的Logistic回归模型可以分辨乙肝后肝硬化的肝胆湿热证和肝郁脾虚证。研究进一步证实证候的物质基础信息能够从人体外周血单个核细胞的组学数据中得到。典型证候的物质基础可能由一组基因或蛋白组成。 (3)通过HBV感染性慢性肝病及其典型证候动态变化的分子生物网络分析，找到疾病或证候顺序变化影响最显著、最主流的基因群和蛋白群。通过qRT-PCR实验证实COL5A1，CDK4，MMP2，SCD在肝病发展过程中具有重要调控作用。疾病发展和证候动态变化都是一种生物网络的动态变化，通过动态分析，找到一组基因或者蛋白可能在动态变化中存在可能的重要调控作用，为更好的理解慢性肝病的发生发展及证候物质基础提供线索。