利用酵母双杂交系统筛选与猪Calsarcin-1基因相互作用的蛋白

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lanrengbuluo
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Calsarcin(Calcineurin-associated sarcomeric protein)基因家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin)结合的肌肉特异蛋白质新家族,已发现的Calsarcin基因家族成员有Calsarcin-1、Calsarcin-2和Calsarcin-3。其中,Calsarcin-1基因在心肌和骨骼肌慢肌纤维中特异表达,Calsarcin-2和Calsarcin-3只在骨骼肌的快肌纤维中特异表达。研究证实,Calsarcin-1基因敲除小鼠的肌肉过度生长,Calcineurin活性升高,表明Calsarcin-1抑制Calcineurin的活性。因此,Calsarcin-1基因可能通过与Calcineurin结合调节Calcineurin的活性,共同参与肌细胞内由Ca2+调控的信息传递功能,从而调控其它相关基因的表达,在肌纤维的分化和发育过程中发挥重要的作用。另外,Calsarcin-1与α-actinin、γ-filamin、telethonin等多种结构蛋白质共定位于Z-disc。因此,推测Calsarcin-1对Z-disc结构的形成和稳定起重要作用。为了更好的认识Calsarcin-1基因及其互作蛋白对肌细胞钙离子的调控作用,了解快慢肌纤维的决定和分化的分子机理,本研究采用酵母双杂交筛选技术对Calsarcin-1相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。主要研究成果如下:1.从pEGFP-N1-CS1荧光表达载体中分离得到Calsarcin-1的编码区,并构建到pGBKT7诱饵表达载体中,获得了能成功表达且无毒性的pGBKT7-CS1诱饵表达载体。2.成功地分离、纯化了猪肌肉组织的双链cDNA,用来表达猎物文库的融合蛋白。3.将诱饵载体、双链cDNA及猎物载体pGADT7-Rec共转化到感受态的酵母细胞中,进行酵母双杂交筛选,初步筛选到与Calsarcin-1相互作用的29个阳性克隆。4.经PCR筛选、酶切、测序和结果分析,获得到3个感兴趣的蛋白(CASQ1、TNNT3和ACTN3)。其中CASQ1和TNNT3参与了肌细胞中对钙离子的调控,ACTN3则参与了维持Z线结构稳定。
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