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家蚕病毒病包括核型多角体病,质型多角体病,软化病和浓核病。家蚕病毒病往往给养蚕业带来重大的经济损失。如何从根本上解决病毒病对蚕业生产的危害,是蚕业学者一直都在研究的课题。有些家蚕品种对浓核毒病表现出完全抵抗性。通过遗传分析已经发现Nid-1,nsd-1,nsd-2, nsd-Z基因分别对不同浓核病毒株系表现抗性。利用图位克隆已经确定nsd-2基因编码家蚕中肠特异表达的氨基酸转运蛋白。家蚕对浓核病毒镇江株BmDNV-Z的不感染性由隐性单基因nsd-Z控制。本研究利用本研究组建立的家蚕功能基因图位克隆平台,对nsd-Z基因进行了图位克隆,利用双向电泳技术对添食BmDNV-Z病毒前后敏感家蚕品系菁松及抗性品系菁松近等基因系中肠蛋白表达变化进行了研究,通过酵母双杂交筛选与病毒蛋白相互作用的家蚕中肠差异表达的基因,并对添毒后家蚕体内差异表达的抗菌肽进行了原核表达及活性分析。主要研究结果如下:
1、筛选到13个与nsd-Z基因连锁的多态性分子标记,对回交群体中457个抗病后代进行基因分型,并构建了遗传连锁图,长度为70.1 cM,nsd-Z与BmDNV-2的抗性基因nsd-2位于遗传图上同一个位点,2侧标记10M15S和35D24S与nsd-Z分别相距4.4和2.5 cM。将nsd-2所编码的氨基酸转运蛋白作为nsd-Z候选基因,分别扩增家蚕菁松、L10和P50 cDNA,克隆nsd-Z基因,发现该基因在3个家蚕品系中各不相同。P50对BmDNV-2敏感,相对于P50的+nsd-基因而言,菁松、L10都是突变型。且该基因在L10中存在8个核苷酸的缺失,该突变导致提前引入终止密码子。菁松对BmDNV-Z敏感,而对BmDNV-2应该表现为抗性;L10应该同时抗BmDNV-Z和BmDNV-2。BmDNV-Z敏感和抗性家蚕品系菁松及NIL在添毒后nsd-Z基因表达水平上调。
2、利用质谱技术鉴定了41个差异表达的蛋白点。鉴定的差异表达的蛋白包括糖酵解酶类,能量代谢酶类,参与基因表达的蛋白以及参与其他细胞功能的蛋白等。烯醇化酶(enolase)在NIL中的表达水平显著高于在菁松内的表达,其可能参与家蚕对BmDNV-Z的抗性。
3、mRNA帽子结合蛋白eIF4E与BmDNV-Z病毒VD1的ORF2之间存在相互作用。将截短的elF4E基因片段连接到pGADT7载体上,构建了8个酵母双杂交载体,通过酵母双杂交发现elF4E aa76-88与BmDNV-Z病毒的ORF2有较大的结合活性。
4、cecropin D、gloverin及nuecin3个抗菌肽基因在家蚕浓核病毒侵染后在家蚕体内 mRNA水平表达上升。原核表达的重组蛋白除了GST-Gloverinl形成包涵体外,GST-CecropinD、GST-Gloverin2、GST-Neueinel以及GST-Neucine2均在细菌裂解液的上清中检测到可溶性表达。其中GST-Gloverin2和GST-Neucine2分别是gloverin和nuecin两个基因去除信号肽序列后的表达产物。Western blot验证了重组蛋白GST-CeeropinD、GST-Gloverinl和GST-Gloverin2的表达。GST亲和层析纯化的重组蛋白 GST-CecropinD、GST-Gloverin2、GST-Neucinel以及GST-Neucine2对细菌有明显的抑制作用。