以秸秆等木质纤维原料为代表的低劣生物质，其纤维素与半纤维素含量丰富，在中国每年有将近7亿吨的产量，若能使用木质纤维原料替代粮食原料应用于生物基产品工业化生产，这将极大推动基础化学品的规模化生物制造。然而，与淀粉基葡萄糖不同，木质纤维水解糖液含有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等糖组分以及预处理过程中生成的水解抑制因子。这些复杂成分构成的生物转化体系对微生物菌株的物质代谢能力及抗逆性能提出了新要求。本论文面向木质纤维原料的高效利用，以丁二酸生产菌株为研究对象，对大肠杆菌木糖代谢机制、多组分糖转运调控机制以及木质纤维水解液抑制因子降解等方面开展研究。主要内容和结论如下:　　(1)建立了常压室温等离子体与适应性进化技术相结合的菌株选育方法，获得了具有木糖利用能力的突变菌株，发现了胞内ATP浓度较高的突变菌株木糖代谢能力更为突出，初步推断ATP供给不足可能是导致重组大肠杆菌丧失木糖代谢能力的关键因素。　　与传统诱变方法相比，常压室温等离子体技术(ARTP)诱变速度快、突变率高、突变库容大，能够有效造成DNA多样性损伤，较易获得遗传稳定性良好的突变菌株。针对丁二酸生产菌株木糖利用能力差的问题，以无木糖利用能力的大肠杆菌NZN111与AFP111等为出发菌株，利用ARTP诱变育种方法获得了具有木糖代谢性能的微生物菌株。　　适应性进化技术利用微生物适应特定环境压力所产生的有益突变实现对微生物的改造，与理性设计策略和酶的定向修饰改造相比，适应性进化可以使菌株在全基因组水平上，发生许多并行的、不同的基因的有益突变。在获得具有木糖利用能力的菌株基础之上，以高浓度木糖作为胁迫环境，通过连续恒化培养的方法获得性能稳定的木糖代谢菌株XY112、XY113和XY115。其中，XY115厌氧发酵72 h消耗18 g/L木糖，细胞干重和丁二酸产量分别达到2.8 g/L和12.1g/L。　　在已有工作及其他相关研究的基础之上，对获得的木糖代谢菌株开展了木糖跨膜转运、碳物质代谢以及关键辅因子(NAD(H)和ATP）代谢三方面的研究工作。通过不同菌株之间木糖转运及代谢性能比较，发现了胞内ATP浓度较高的大肠杆菌木糖利用及丁二酸合成能力更为突出，同时木糖代谢菌株中起到催化底物水平磷酸化反应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶酶活较高，由此推断ATP供给不足可能是导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长的关键因素。　　(2)通过引入外源底物水平磷酸化关键酶，提高了菌株胞内ATP供给能力，结合系列同源重组大肠杆菌的ATP代谢分析，进一步确定了ATP供给不足是导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长合成丁二酸的关键因素。　　为考察ATP供给不足是否为导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长的关键因素，以敲除了编码丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB和乳酸脱氢酶基因ldhA的大肠杆菌BA002为出发菌株，引入外源底物水平磷酸化关键酶，提高ATP供给能力，恢复了大肠杆菌厌氧条件下利用木糖代谢生长并生成丁二酸的能力，结果表明，构建的重组大肠杆菌BA204，胞内ATP浓度提高了近1倍，厌氧发酵48h，消耗13 g/L木糖生成11.6 g/L丁二酸。此外，BA204发酵含80％木糖的脱毒玉米芯稀酸水解糖液72 h，丁二酸浓度达到10.15 g/L，丁二酸得率达到0.96 g/g。　　结合已有工作基础，将系列同源重组大肠杆菌进行ATP代谢分析，结果表明，原始菌株K12 ATP浓度最高，菌体生长速率及木糖代谢速率最快，敲除了乳酸脱氢酶基因ldhA和丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB后，尽管消除了甲酸和乳酸等副产物，但是乙酸等ATP伴生型产物合成大幅减弱，ATP浓度较低，菌株生长与木糖代谢也随之停滞。而过量表达pck基因的BA204，胞内ATP浓度升高，恢复了厌氧条件下代谢木糖生长并合成丁二酸的能力，这进一步确定了ATP供给不足是导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长合成丁二酸的关键因素。　　(3)通过基于糖转运调控因子的分子改造，实现了多组分糖的同步利用以及ATP的合理化分配。　　在获得优异木糖代谢能力菌株的基础上，如何开发菌株高效、同步利用木质纤维水解液中的多组分糖资源，是实现其碳资源高效利用的共性问题。通过研究糖转运调控机制，敲除五碳糖、六碳糖共利用阻抑调控蛋白，实现了厌氧条件下五碳糖和六碳糖的同步利用，使菌株生产速率及效率进一步提高。　　将新构建的混合糖同步利用菌株BA305与出发菌株BA204进行了性能比较分析，考察了糖转运系统改造对ATP代谢调节的影响。结果表明，由于PTS对糖转运的调节作用，BA204在糖利用过程中出现顺序性，ATP趋势线在碳源转换时出现拐点，趋势线斜率k1明显大于斜率k2，糖利用速率明显降低。而在BA305中，由于获得了同步利用混合糖能力，葡萄糖代谢所产生的高浓度ATP可补充木糖代谢，ATP趋势线无明显变化，BA305混合糖消耗速率明显高于BA204，表明糖转运系统改造对ATP代谢调节具有显著效果，这对于基于ATP代谢调节构建木质纤维原料高效利用菌株有着积极的指导意义。　　(4)通过纤维素水解物抗逆元器件的构建，对木质纤维素水解液进行生物脱毒，结合菌渣回用技术提供有机氮源，避免了活性炭、菌渣等的二次污染，利用优异的混合糖代谢菌株实现了木质纤维原料的高效利用。　　针对玉米芯、甘蔗渣等木质纤维原料水解抑制物较多的问题，以糠醛物质作为抑制物典型成分，在重组大肠杆菌中过量表达高效代谢糠醛抑制物的抗逆器件FucO基因，使糠醛物质降解为低毒性的醇类物质，从而达到木质纤维素水解液生物脱毒的效果。　　当生物脱毒结束后，菌体细胞与甘蔗渣水解液分离，若不能及时处理菌渣，将形成新的废弃物，为此，利用菌渣回用技术将蛋白酶解细胞作为有机氮源使用，在解决发酵过程中添加高成本酵母粉问题的同时，又可以避免菌体细胞造成的二次污染。以物理及生物脱毒甘蔗渣水解液为碳源、细胞酶解液为氮源，一步厌氧发酵木糖生产丁二酸的过程中，BA305细胞干重最高可达到4.58 g/L，丁二酸浓度达到39.3 g/L，丁二酸总得率达到0.97 g/g总糖。