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目的：建立实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测烟曲霉DNA的方法；通过动物实验和临床研究，评价RT-PCR检测血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中烟曲霉DNA对侵袭性曲霉病(IA)的诊断价值。
方法：①动物实验：清洁级健康成年SD大鼠30只，按随机区组设计分为烟曲霉肺感染组、烟曲霉口咽定植组，每组15只，2组再随机分为第1d、第4d、第7d处死组。经气管插管滴入烟曲霉混悬液建立大鼠侵袭性肺曲霉病(IPA)模型，经鼻腔和口咽滴入法建立大鼠烟曲霉口咽定植模型。分别于接种完成后第1d、第4d、第7d处死大鼠，取各组大鼠心脏血，离心取上层血清-20℃保存，肺泡灌洗留BALF，进而离心取下层沉淀-20℃保存，采用RT-PCR检测血清和BALF中烟曲霉DNA，并取肺组织标本进行培养和病理学检查(HE、PAM染色)。分别配制孢子浓度为106/ml的烟曲霉、黄曲霉、白念珠菌和新生隐球菌混悬液，108cfu/ml肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌混悬液，对各混悬液提取的DNA进行RT-PCR检测，评价RT-PCR检测烟曲霉DNA的特异性。②临床研究：2007年3月～2008年5月南京军区南京总医院住院患者20例，平均54.5±18.8岁，其中男性15例，女性5例。包括IPA组11例，其他IFI组9例(其中血源播散性念珠菌7例、侵袭性肺隐球菌2例)。所有患者于起病后2～20d(平均10.5±5.6d)留取静脉血，离心取上层血清-20℃保存。③RT-PCR方法：选取烟曲霉核糖体DNA(rDNA)中的内转录间隔区1(ITS1)设计引物和探针，用ABI7300荧光PCR仪检测烟曲霉DNA。反应参数：50℃×2min、95℃×10min、(95℃×15s+60℃×1min，40cycle)，以105、104、103、102/ml烟曲霉混悬液提取的DNA建立标准扩增曲线，以102/ml烟曲霉混悬液提取的DNA作为阳性对照，阴性对照为蒸馏水。以前15个循环作为荧光本底信号，荧光本底信号决定荧光阈值，当扩增产物荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的循环数，称作阈值循环数(Ct)，RT-PCR检测结果以Ct值表示。
结果：①动物模型肺组织病理学检查：烟曲霉感染组大鼠在第4d和第7d光镜下均见明显炎症反应，第1d烟曲霉感染组大鼠肺组织中未见曲霉菌丝，第4d(死亡1只不列入统计)和第7d烟曲霉感染大鼠肺组织中见曲霉菌丝或孢子，14只大鼠肺组织培养曲霉阳性；烟曲霉口咽定植组大鼠肺组织未见明显炎症反应和其它异常的病理改变，14只大鼠口咽拭子培养曲霉阳性。②RT-PCR检测结果：RT-PCR检测烟曲霉混悬液提取DNA阳性，检测黄曲霉、白念珠菌、新生隐球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及蒸馏水中提取DNA结果均为阴性。RT-PCR扩增线形方程y=3.11451gx+17.2466，其中y代表Ct值，x代表起始DNA量。③动物实验结果：烟曲霉感染组和烟曲霉口咽定植组大鼠血清检测Ct值分别为23.8±2.11和26.3±1.26，两组比较P<0.05；烟曲霉感染组和烟曲霉口咽定植组大鼠BALF检测Ct值分别为25.0±3.57、26.2±1.02，两组比较P>0.05，烟曲霉感染组大鼠第1d、第4d、第7d BALF检测Ct值分别为26.0±3.51、25.8±5.42和23.3±1.25，三个时间点比较P>0.05。烟曲霉感染组大鼠第1d、第4d、第7d血清检测Ct值分别为25.0±1.44、24.5±1.27和22.2±2.40，三个时间点比较P>0.05。以Ct值为25作为诊断阈值时，RT-PCR检测血清烟曲霉DNA诊断IA的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为71.4％、87.5％、83.3％和75.0％；接种完成后第1d、第4d和第7d血清烟曲霉DNA检测诊断IA的敏感性分别为40％、75％和100％。④临床研究结果：IPA组患者血清RT-PCR检测Ct值23.3±4.00低于其他IFI感染组27.4±0.88，两组比较P<0.05。以Ct值为25作为诊断阈值时，血清烟曲霉DNA检测诊断IPA的敏感性、特异性、PPV和NPV分别为63.6％、100％、100％和69.2％。
结论：①采用烟曲霉特异性引物和探针进行RT-PCR检测能特异性扩增并定量分析血清与BALF中的烟曲霉DNA；②RT-PCR检测大鼠血清烟曲霉DNA能区分烟曲霉感染与烟曲霉口咽定植，临床血清标本RT-PCR检测能区分IPA与其他IFI；③以Ct值为25作为诊断阈值时诊断IA的敏感性、特异性较理想；④RT-PCR检测大鼠血清烟曲霉DNA诊断IA的敏感性随感染时间的延长而增加。