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目的:通过观察人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCEC)在波动性高糖环境下神经生长因子(Human nerve growth,NGF)及阿片类生长因子(Opioid growth factor,OGF)含量的变化,及对角膜上皮细胞增殖、迁移、凋亡等产生的影响,探讨体外使用重组人神经生长因子(Recombinant human nerve growth factor,rhNGF)和纳曲酮(Naltrexone,NTX)促进角膜上皮细胞增殖的合适作用剂量,从而为糖尿病角膜上皮病变发病机制及治疗提供一种新思路。方法:1.以HCEC为研究对象,分为2组培养:5.5mmol/l稳定性正常糖浓度组(Steady normal glucose,SNG)、波动性高糖浓度组(Fluctuant high glucose,FHG)(5.5mmol/l葡萄糖DMEM完全培养基培养8小时后换液成50mmol/l DMEM完全培养基)细胞培养1w后进行细胞形态学观察,并吸取细胞培养上清液,ELISA法检测rhNGF、OGF含量变化。2.筛选NTX及rhNGF合适浓度及处理时间:在FHG组中分别添加不同剂量rhNGF及不同剂量NTX,分别培养24h、36h、48h、60h、72h,CCK8法测定细胞增殖,确定rhNGF及NTX的浓度及处理时间。3.取rhNGF及NTX合适处理浓度浓度和时间,对稳定性正常糖浓度组(SNG)和波动性高糖浓度组(FHG)分别予以不同处理:阴性对照组、rhNGF组、NTX组、rhNGF+NTX组。(1)细胞平板克隆实验测定细胞增殖活性。(2)细胞划痕实验检测HCEC细胞迁移能力。(3)流式细胞术检测HCEC细胞凋亡率。结果:1.ELISA检测显示:与SNG组相比,FHG组细胞培养上清液中rhNGF含量下降(P<0.05),OGF含量上升(P<0.05)。2.(1)与SNG相比,FHG组HCEC细胞增殖活性降低,细胞凋亡率增加,细胞迁移能力下降(均P<0.05)。(2)FHG组在加入rhNGF或NTX后细胞增殖活性较未加药前HCEC升高,细胞凋亡率减少,细胞迁移能力增加(均P<0.05)。(3)加入rhNGF或NTX的FHG组细胞,增殖活性仍较SNG组低(P<0.05),细胞凋亡率较SNG组高(P<0.05),细胞迁移能力高于SNG组(P<0.05)。3.rh NGF和NTX促进HCEC增殖的合适浓度分别为125ng/ml(P<0.05)及250μmol/l(P<0.05)。且rhNGF和NTX联用组较单用rh NGF或NTX组对HCEC增殖作用更强(P<0.05)。结论:1.波动性高糖环境可抑制HCEC增殖活性,诱导HCEC凋亡,NGF表达量降低,OGF表达量增加。2.rhNGF及NTX在波动性高糖环境下可提高HCEC细胞增殖活性,减少HCEC细胞凋亡,促进HCEC细胞迁移。125ng/mlrhNGF与250μmol/l NTX可能是其发挥对人角膜上皮细胞保护作用的合适浓度。且rhNGF和NTX对人角膜上皮细胞的保护可能具有协同作用。