糖尿病是由基因和环境因素相互作用而引起的糖代谢紊乱疾病,特点是胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足而引起血糖过高。糖代谢的混乱能引发很多种并发症,是肿瘤、心血管病变之后第三大严重影响人类康健的慢性、非传染疾病。早期研究表明从条纹斑竹鲨再生肝脏分离的鲨肝活性肽(APSL)能抗脂质过氧化,清除自由基,保护、修复受损肝脏和胰岛β细胞。药理药效研究表明将家蚕表达的CTB-APSL融合蛋白制备口服剂型,灌胃给与2型糖尿病模型小鼠,能有效保护胰岛细胞,修复其受损细胞,促使其增加胰岛素分泌达到降血糖作用。随着条纹斑竹鲨再生肝脏c DNA文库高通量测序完成,通过生物信息学分析,发现APSL存在shark TBC1D15序列的N端,即APSL全蛋白是鲨鱼中TBC1D15家族的新成员,但未开展其功能研究。本实验根据已报道的TBC1D15蛋白功能,开展了APSL全蛋白的功能验证,并检测APSL全蛋白Rab-GAP的特异性。前期生物信息学分析表明APSL全蛋白的基因序列包含具有GAP活性的domain结构域,结构域中有TBC家族典型的六个motifs A-F,与人TBC domain同源性高达91%。有研究表明蛋白TBC1D15对Rab7/Rab11蛋白具有GAP活性。因此,利用大肠杆菌表达系统表达APSL全蛋白和融合蛋白MBP-Rab7-WT(野生型)、MBP-Rab7-Q67L(激活型)、MBP-Rab7-T22N(抑制型),利用His pull down实验检测APSL全蛋白与融合蛋白Rab7的相互作用,结果表明,APSL全蛋白能结合Rab7,且与不同的形态Rab7蛋白结合量不一样,提示APSL全蛋白具有Rab-GAP活性。此外,为了进一步研究APSL全蛋白对不同Rab蛋白的GAP活性特异性,分别构建重组质粒p ETduet-His-sumo-Rab4/Rab5/Rab8/Rab11,同时重新构建重组质粒p ETduet-His-sumo-Rab7-WT,分别在大肠杆菌系统中诱导表达,并纯化融合蛋白His-sumo-Rab4/Rab5/Rab7/Rab8/Rab11。通过分析Rab蛋白水解GTP为GDP时Pi的释放量,间接反应出APSL全蛋白对Rab蛋白的GAP活性的特异性。实验结果表明,APSL全蛋白对Rab蛋白具有GAP活性特异性,且APSL全蛋白对Rab11蛋白的活性最强,对Rab4蛋白基本没有活性。根据其序列结构和功能特点可推测出,APSL全蛋白是在鲨鱼中发现的TBC1D15蛋白,命名为shark TBC1D15蛋白,其属于TBC1D15家族。为了研究shark TBC1D15蛋白的表达和调控,结合本实验室的研究平台,开展了mi RNA对其调控的研究,以进一步探索shark TBC1D15蛋白可能具有的功能。采用双荧光素酶报告基因法研究mi RNA对shark TBC1D15靶基因的调控。目前已筛选出一个可以调控shark TBC1D15基因的mi RNA。本课题通过TBC1D15家族所具有的Rab-GAP功能,验证了APSL全长蛋白是TBC1D15家族的新成员,这是shark TBC1D15的首次报道,增添了TBC1D15家族的丰富性。mi RNA与shark TBC1D15基因相互作用的研究为探索APSL降血糖的机制及特定mi RNA对糖代谢的调控提供了新的思路。