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由革兰氏阴性菌水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病是水稻生产上最严重的细菌性病害,Xoo还是研究植物——病原菌互作的重要模式细菌.为研究Xoo致病的分子机制,我们用近年来发展的基于转座子Tn5的转座体(Transposome)建立了XooPXO99的突变体库,从转座子插入的随机性、稳定性和突变体库的饱和性三方面评价了突变体库的质量.Southern杂交和TAIL-PCR(热不稳定交错PCR)分析表明转座子在Xoo基因组上大多为单拷贝插入,插入随机性好,且转座子的插入稳定.通过这种转座体系共获得18000个突变体,其饱和度达到了98﹪.为进一步确定和分离Xoo的致病相关基因及其功能基因组研究奠定了基础.通过致病性分析,从10000多个突变体中筛选到在水稻品种IR24上致病性明显下降或完全丧失的突变体108个.Southern blot分析表明,有86个突变体(80﹪)的转座子在基因组上为单拷贝插入.在PSA培养基上,大多数致病相关突变体的培养特征与野生型相同,能正常分泌胞外酶.通过TAIL-PCR分离的转座子侧翼片断属于45个基因,还有8个突变体的插入位点在内源转座子上或基因间.45个基因中与分泌系统有关的基因(20个)占了将近一半,说明分泌系统对致病性的重要作用.其他主要是一些与细菌的胞外多糖、脂多糖合成有关及与细菌的代谢、基因调节有关的基因.有22个突变体的转座子插入位点在hrp基因簇的12个基因上,通过Southern blot验证突变体中转座子插入的位置,RT-PCR分析转座子的插入对hrp基因簇中hrp基因表达的影响.BLAST分析表明除在hrpE和hrpF基因间存在较大的变异性外,Xoo PXO99的hrp基因簇与其他小种的序列同源性很高.通过PCR克隆测定PXO99中4Kb的变异区序列,我们得到了PXO99中hrp基因簇的全序列.在108个致病相关突变体中,发现有四个突变体,其转座子插入到同一ORF的不同位点,根据TAIL-PCR获得的突变体侧翼序列设计引物,用PCR的方法克隆了这一基因.序列分析表明,它与许多病原细菌中的Ⅱ型分泌系统结构基因xpsE高度同源.由于转座子的插入,突变体中木聚糖酶,纤维素酶等胞外酶不能有效分泌到胞外,至少有两种蛋白在胞间周持累积,Western blot也表明突变体中纤维素酶的分泌受阻.通过广寄主范围载体pHM1把xpsE基因转入突变体后,xpsE基因的表达恢复,其致病性及胞外酶的分泌也和Xoo野生型相似.