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植物体是一个开放体系,生存于自然环境中,它的生长发育都要受到环境的影响。在自然环境中,不能避免地会出现不适宜植物生长发育所需要的环境,会影响植物体的正常发育。近年来,由于全球环境的日益恶化,低温、高温、干旱等恶劣的气候严重地影响了植物的正常生长发育,特别是农作物的生长发育。水稻(Oryza sativa L.)作为我国重要的粮食经济作物之一,其栽培总面积、总产量和单位面积产量均居各类粮食作物首位。而近年来,越来越严重的环境因素严重地影响水稻的产量,因此目前对于水稻抗逆研究一直是稻作科学研究的重要课题之一,对于抗逆基因的发掘已成为水稻遗传资源与品种改良研究的热点,并且已经发现了很多与水稻抗逆有关的基因,热激蛋白就是其中的一个典型。
热激蛋白(Heat Shock Protein, Hsp)是一种在生物界普遍存在的蛋白质,能在应激条件下高效表达,参与一些重要的细胞生理活动。Hsp的生物学功能具有多样化的特点,除了可增强细胞对逆境的耐受能力和充当分子伴侣外,还与植物的正常生长、发育与分化、细胞内信号传导和表型变异等有关。本研究以OsHsp90为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白,对筛选出的新基因Os-unkown protein(以下简称为OsUnP)进行功能分析,试图能够进一步分析和揭示水稻热激蛋白Hsp90家族及其结合蛋白在相互作用及信号转导等方面的作用,为深入研究OsHsp90与其互作蛋白间的互作机制打下坚实的基础。研究结果如下:
1.运用酵母双杂交技术,以OsHSP90为诱饵,根据Clontech提供的方法,从水稻低温和干旱cDNA文库中筛选到未知功能蛋白OsUnP。
2.通过数据库比对分析OsUnP,该基因cDNA全长1058bp,编码区位子138bp-666bp,编码176个氨基酸残基,预测分子量约19.7KD。通过氨基酸同源性比较,发现OsUnP与其他品种该蛋白的同源性较高:与水稻粳亚种(Q656U1,Oryza sativasubsp. Japonica)、水稻籼亚种(A2WRH6,Oryza sativa subsp. Indica)中的蛋白质相似性最高,分别达到99%和98%,与玉米(B6T6A1,Zea mays)和小立碗藓种(A9SC52,Physcomitrella patens subsp. Patens)中的蛋白质相似性依次递减,分别为73%和48%,而与外源对照-大豆(C6SZA4,Glycine max)中的H3家族蛋白的相似性只有11%。此外,由于都有DUF866功能域的存在,它们在蛋白质功能上有可能起着相同或相似的作用。
3.运用半定量RT-PCR分析OsUnP和OsHSP90在低温、高温、干旱和高盐等胁迫下以及在水稻不同生理时期各组织中的表达情况,发现二者在未经逆境胁迫处理时,均出现不同程度的表达;在高温、高盐逆境下的表达趋势存在一致性;而在干旱逆境下,则呈现相反的表达趋势;在水稻不同生理期的节间、节、叶、叶鞘、枝、颖壳等组织中均有表达。
4.构建OsUnP基因cDNA片段的超表达、反义及GFP表达载体,并以根癌农杆菌介导导入水稻愈伤组织中,出苗成株。拟通过研究该基因转基因植株在大气环境及各种逆境胁迫下外观形态、生理指标等的变化,揭示该基因的功能,为该基因在抗逆育种中的应用打下基础。