NAFLD对肝内胆管癌肝切除预后的影响及SULT2B1b表达与肿瘤侵袭的相关性和机制

来源 :海军军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ziyi1965
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本文从以下三部分进行了阐述:
  第一部分 非酒精性脂肪性肝病对肝内胆管癌肝切除预后的影响
  目的:肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是发病率仅次于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的第二种原发性肝癌,近十年来该病在全世界范围内的发病率显著上升。非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liverdisease,NAFLD)已成为ICC的主要危险因素之一。本研究旨在评价NAFLD对ICC肝切除预后的影响。
  方法:本研究收集2003年至2011年在海军军医大学东方肝胆外科医院接受肝切除治疗的ICC病人的临床病理资料。根据纳入和排除标准将1045例病人纳入本研究,其中214例伴有NAFLD,831例不伴有NAFLD。本研究纳入的病人均行肿瘤根治性切除,且术后病理诊断为ICC。本研究的终点为至复发时间(time to recurrence,TTR),肿瘤特异性生存(cancer-specific survival,CSS)以及总体生存(overall survival,OS)。根据Kaplan-Meier方法估算病人术后复发率、CSS率和OS率,Log-Rank检验方法进行组间差异比较。选取单因素分析有统计学意义的变量进入COX等比例风险回归模型筛选影响复发、CSS和OS的独立危险因素。采用倾向性评分匹配(propensity score matching,PSM)降低两组之间基线资料差异相关的选择性偏倚,采用第八版AJCC/TNM分期系统对ICC进行临床分期。
  结果:与非NAFLD相关ICC(Non-NAFLD-ICC)病人相比较,NAFLD相关ICC(NAFLD-ICC)病人的超重和患有2型糖尿病的比例更高(64.0% vs.21.7%,P<0.01;15.9% vs.4.0%,P<0.01),伴肝硬化的比例更低(7.0% vs.25.2%,P<0.01)。NAFLD-ICC病人术后并发症的发生率较Non-NAFLD-ICC病人更高(28.5% vs.18.5%,P=0.001)。伴或不伴有NAFLD的ICC病人的5年复发率、CSS率和OS率均无显著性差异(88.5% vs.83.4%,P=0.100;24.4%vs.29.3%,P=0.200;20.4% vs.28.2%,P=0.100)。根据AJCC/TNM分期进行分层分析显示:在Ⅰ/Ⅱ期病人中,NAFLD-ICC病人的5年复发率显著高于Non-NAFLD-ICC病人(86.1% vs.80.1%,P=0.030),5年CSS率和OS率均显著低于Non-NAFLD-ICC病人(23.3% vs.35.1%,P=0.030;20.5% vs.33.5%,P=0.020)。经1∶1 PSM配对后,AJCC/TNM分期Ⅰ/Ⅱ期NAFLD- ICC和Non-NAFLD-ICC组均为135例病人。NAFLD-ICC病人仍然获得较差的远期预后(5年复发率:86.3%vs.75.9%,P=0.040;5年CSS率:23.3% vs.38.5%,P=0.040;5年OS率:21.2% vs.35.8%,P=0.040)。多因素分析显示,肿瘤分期为Ⅰ/Ⅱ期时,NAFLD是影响术后复发、CSS和OS的独立危险因素(风险比[hazard ratio,HR]:1.56,95%置信区间[confidence interval,CI]:1.17-2.08;1.43,1.05-1.95;1.44,1.06-1.95)。
  结论:伴或不伴有NAFLD的ICC病人,其肝切除术后5年复发率、CSS率和OS率均无显著性差异。对于AJCC/TNM分期Ⅰ/Ⅱ期的病人,NAFLD-ICC的远期预后较Non-NAFLD-ICC更差。
  第二部分 SULT2B1b基因在NAFLD-ICC中的表达及其验证
  目的:前期研究发现在早期ICC中,NAFLD-ICC较Non-NAFLD-ICC的远期预后更差。本研究利用二代基因测序方法检测NAFLD-ICC与Non-NAFLD-ICC的差异表达基因,探索参与NAFLD-ICC发生和发展的相关基因,及其在ICC分子分型中的潜在作用。
  方法:对43例行根治性肝切除的ICC肿瘤组织及配对的癌旁肝组织行转录组二代基因测序。通过生物信息学分析比对鉴定表达差异基因,进行GO、KEGG信号通路富集及文献回顾筛选出其中与NAFLD相关基因,并根据差异基因表达水平行术后生存分析。在筛选发现羟基类固醇硫酸转移酶(hydroxysteroid Sulfotransferases)2B1b(SULT2B1b)基因与NAFLD-ICC发生和发展具有相关性并且影响预后的基础上,进一步对105例ICC病人的肿瘤组织石蜡切片行免疫组化染色,验证SULT2B1b蛋白表达水平与NAFLD-ICC预后的相关性。
  结果:转录组测序发现多个差异表达信号分子。通过对基因表达水平,表达水平与预后的相关性,以及所处信号通路分析,筛选出SULT2B1b基因。该基因在NAFLD-ICC肿瘤组织中的表达水平显著高于Non-NAFLD-ICC肿瘤组织,同时也显著高于正常肝组织,并且SULT2B1b基因高表达组的术后远期预后显著差于低表达组。免疫组化染色发现,SULT2B1b蛋白高表达的病人,其术后复发率显著高于低表达的病人,OS也显著差于后者。多因素COX比例回归风险模型证实NAFLD-ICC肿瘤组织中SULT2B1b蛋白高表达和较晚的AJCC/TNM分期均为ICC病人术后复发和OS的独立危险因素。
  结论: SULT2B1b基因及其编码蛋白在NAFLD-ICC肿瘤组织中高表达,且其高表达与ICC术后较差的远期预后具有显著的相关性。
  第三部分 SULT2B1b基因在ICC细胞中的功能研究
  目的:前期临床研究发现在早期ICC中NAFLD-ICC的远期预后差于Non-NAFLD-ICC;转录组测序等研究发现SULT2B1b基因及其编码蛋白在NAFLD-ICC肿瘤组织中高表达,其高表达是ICC不良预后的独立危险因素。本部分研究旨在探讨SULT2B1b在ICC中的生物学功能。
  方法:通过qRT-PCR检测3种ICC细胞系中SULT2B1b基因mRNA的表达水平,采用瞬转干扰RNA(siRNA)方法对SULT2B1b基因高表达细胞系QBC939行该基因敲减,通过CCK-8实验测定SULT2B1b基因敲减对ICC细胞增殖能力影响;通过构建慢病毒感染实现对ICC细胞系SULT2B1b基因的稳定敲减,利用慢病毒稳转ICC细胞建立ICC裸鼠皮下成瘤模型,通过在体动物实验验证SULT2B1b基因表达与ICC细胞增殖能力的相关性。根据细胞划痕及Transwell小室侵袭实验验证SULT2B1b基因敲减对ICC细胞迁移及侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测SULT2B1b基因敲减对ICC细胞周期及凋亡的影响。
  结果:siRNA干扰后QBC939细胞SULT2B1b蛋白表达下调;CCK-8细胞增殖实验表明干扰SULT2B1b表达可抑制ICC细胞的增殖;裸鼠皮下ICC成瘤模型证实SULT2B1b基因敲减降低ICC的增殖能力。划痕实验表明干扰SULT2B1b可抑制ICC细胞的迁移,Transwell小室侵袭实验表明干扰SULT2B1b可显著减弱ICC细胞的侵袭能力。流式细胞分析结果显示干扰SULT2B1b基因表达可使ICC细胞出现G2/M期阻滞,对细胞凋亡无明显影响。
  结论:干扰SULT2B1b基因表达可显著抑制ICC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
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