论文部分内容阅读
研究目的:
甲状腺癌作为内分泌系统常见的恶性肿瘤，在头颈部肿瘤中占有很大比率，居女性恶性肿瘤第四位，其中乳头状甲状腺癌占绝大多数。肉碱脂酰转移酶1(CPT1)作为一种β-氧化途径的关键酶，对脂肪酸分解代谢具有重要调控作用。目前CPT1主要有CPT1A、CPT1B、CPT1C三个家族成员存在。作为调控代谢的限速酶，越来越多研究发现，在肿瘤的代谢过程中CPT1同样起着重要调节作用。CPT1在各个组织和细胞中表达有很大差异，具有一定组织特异性:其中CPT1A分布较为广泛，在多数组织中存在，在肝脏部位高表达;CPT1B则是主要分布在肌肉部位;CPT1C则主要分布在脑部，主要集中在中枢神经系统，例如海马体、杏仁核和下丘脑核，在认知和学习，摄食行为和身体能量消耗以及情绪应对的内分泌调节中都起着很重要的作用。
CPT1C是CPT1家族中唯一能被p53调控的蛋白质，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞能量代谢调节的关键分子。为了维持增殖和侵袭能力，肿瘤细胞会对其能量代谢过程进行调节，在这些过程中，AMPK发挥非常重要的作用。研究发现，AMPK的激活能够诱导cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，使其处于活化状态，并且促进核内的过氧化物酶体增殖受体γ共激活因子-1β(PGC-1β)的活性增强和雌激素相关受体α(ERRα)的蛋白表达增加，从而促进CPT1C蛋白表达，CPT1C是CPT1家族中唯一能被p53调控的蛋白质，参与肿瘤细胞的增殖与凋亡。
凋亡(Apoptosis)作为一种细胞的基本生物学变化，在多细胞生物生长增殖过程中，参与去除不需要的或者异常的细胞，在生物体的进化和内环境中都起着重要作用。凋亡与人类多种疾病的发生密切相关，尤其是在肿瘤的形成中发挥重要作用。在肿瘤的发生发展中，凋亡也是一把双刃剑，一方面可以针对性启动细胞的死亡，抑制肿瘤细胞的发生、发展;另一方面又可以维持肿瘤细胞的生存，抑制因营养物质缺乏、低氧、氧化应激、电离辐射、化疗以及炎症对肿瘤细胞的损伤，提高肿瘤细胞在不良环境中的生存能力，从而导致肿瘤细胞产生耐药性。
但在甲状腺癌中CPT1C与凋亡的相关研究尚未见报道。综合以上研究背景，我们推测在甲状腺癌中，基于AMPK/PPARa通路在代谢应激状态下CPT1C促进甲状腺乳头状癌细胞进展。本课题拟通过细胞实验、分子生物学实验、临床样本分析，结合基因干扰、过表达等手段研究CPT1C对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性的调控作用，进一步阐明甲状腺乳头状癌的致病分子机制，为其早期诊断和治疗提供坚实的理论依据和潜在的药物靶点。
第一章 代谢应激条件下CPT1C表达与甲状腺乳头状癌细胞的存活关系研究
研究方法:
课题组应用临床收集的乳头状甲状腺癌临床样本，对CPT1C的核酸表达水平进行对比分析;同时在甲状腺癌细胞系中沉默CPT1C后检测甲状腺癌细胞的细胞活性、周期和凋亡情况;进一步构建应激模型，采用不同的应激刺激检测CPT1C的表达情况。
研究结果:
1、在48例患者中，34例(71％)患者肿瘤中的CPT1C mRNA表达量显著高于癌旁正常组织;
2、在乳头状甲状腺癌细胞系KTC-1中通过转染siRNA干扰CPT1C表达，发现沉默CPT1C后可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡的发生，并使G2/M期细胞比例降低，G1期细胞比例增加;
3、在低氧应激模型中，随着低氧时间的延长，KTC-1和B-CPAP细胞中CPT1C的表达逐渐升高;在低糖应激模型中，葡萄糖浓度的逐渐降低也导致KTC-1和B-CPAP细胞中CPT1C的表达逐渐升高;
4、干扰CPT1C后，细胞在缺氧和低糖情况下的存活率均明显降低;过表达CPT1C可显著提高细胞在缺氧和低糖情况下的存活率。
研究结论:
乳头状甲状腺癌癌组织的CPT1C mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织;CPT1C对甲状腺癌细胞增殖、迁移、凋亡等生物学特性具有重要调控作用;低氧、低糖等代谢应激可上调甲状腺癌细胞中CPT1C的表达水平;CPT1C对代谢应激下的甲状腺癌细胞的存活具有重要调节作用。
第二章 代谢应激下乳头状甲状腺癌细胞中CPT1C表达上调的分子机制研究
研究方法:
采用代谢应激模型，检测AMP激活的蛋白激酶-过氧化物酶体增殖激活物受体α(PPARα)通路（AMPK-PPARα）水平变化;结合AMPK特异性激动剂和抑制剂，研究AMPK在CPT1C上调中的作用。
研究结果:
1、在低糖环境下，与CPT1C表达量增加相一致，AMPK的活性（磷酸化AMPK水平）增加，PPARα的表达水平也明显增加;
2、AMPK激动剂AICAR可在显著提高细胞内p-AMPK水平的同时，浓度依赖性地上调细胞内CPTIC的表达水平;
3、AMPK抑制剂Compound C不仅抑制了细胞本底状态下AMPK的活性和PPARα、CPT1C的表达，还可在代谢应激条件下，显著抑制AMPK的激活和PPARα、CPT1C表达水平的升高。同时，AMPK抑制剂Compound C还更加促进了肿瘤细胞的凋亡，降低了肿瘤细胞的活性。
研究结论:
代谢应激下AMPK-PPARα通路的激活与CPT1C表达水平升高同步;CPT1C和PPARα表达水平升高可能依赖于AMPK的激活作用。
第三章 代谢应激下乳头状甲状腺癌细胞中PPARα对CPT1C表达的调控
研究方法:
用转染siRNA的方法干扰PPARα的表达，观察在本底和代谢应激状态下对CPT1C表达水平的影响;构建CPT1C荧光素酶报告基因质粒，观察PPARα是否可直接促进CPT1C的转录。
研究结果:
1、干扰PPARα表达后，无论是正常状态下，还是在低糖低氧的代谢应激下，细胞内CPTIC的表达水平均受到明显抑制;
2、干扰PPARα表达对细胞本底状态下凋亡的影响不大，但显著提高了代谢应激下凋亡细胞的比例，降低了肿瘤细胞的存活;
3、过表达PPARα可显著增加CPT1C启动子的转录活性。
研究结论:
代谢应激下，PPARα可以直接作用于CPT1C启动子，从转录水平上调控CPT1C的表达。
甲状腺癌作为内分泌系统常见的恶性肿瘤，在头颈部肿瘤中占有很大比率，居女性恶性肿瘤第四位，其中乳头状甲状腺癌占绝大多数。肉碱脂酰转移酶1(CPT1)作为一种β-氧化途径的关键酶，对脂肪酸分解代谢具有重要调控作用。目前CPT1主要有CPT1A、CPT1B、CPT1C三个家族成员存在。作为调控代谢的限速酶，越来越多研究发现，在肿瘤的代谢过程中CPT1同样起着重要调节作用。CPT1在各个组织和细胞中表达有很大差异，具有一定组织特异性:其中CPT1A分布较为广泛，在多数组织中存在，在肝脏部位高表达;CPT1B则是主要分布在肌肉部位;CPT1C则主要分布在脑部，主要集中在中枢神经系统，例如海马体、杏仁核和下丘脑核，在认知和学习，摄食行为和身体能量消耗以及情绪应对的内分泌调节中都起着很重要的作用。
CPT1C是CPT1家族中唯一能被p53调控的蛋白质，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是细胞能量代谢调节的关键分子。为了维持增殖和侵袭能力，肿瘤细胞会对其能量代谢过程进行调节，在这些过程中，AMPK发挥非常重要的作用。研究发现，AMPK的激活能够诱导cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，使其处于活化状态，并且促进核内的过氧化物酶体增殖受体γ共激活因子-1β(PGC-1β)的活性增强和雌激素相关受体α(ERRα)的蛋白表达增加，从而促进CPT1C蛋白表达，CPT1C是CPT1家族中唯一能被p53调控的蛋白质，参与肿瘤细胞的增殖与凋亡。
凋亡(Apoptosis)作为一种细胞的基本生物学变化，在多细胞生物生长增殖过程中，参与去除不需要的或者异常的细胞，在生物体的进化和内环境中都起着重要作用。凋亡与人类多种疾病的发生密切相关，尤其是在肿瘤的形成中发挥重要作用。在肿瘤的发生发展中，凋亡也是一把双刃剑，一方面可以针对性启动细胞的死亡，抑制肿瘤细胞的发生、发展;另一方面又可以维持肿瘤细胞的生存，抑制因营养物质缺乏、低氧、氧化应激、电离辐射、化疗以及炎症对肿瘤细胞的损伤，提高肿瘤细胞在不良环境中的生存能力，从而导致肿瘤细胞产生耐药性。
但在甲状腺癌中CPT1C与凋亡的相关研究尚未见报道。综合以上研究背景，我们推测在甲状腺癌中，基于AMPK/PPARa通路在代谢应激状态下CPT1C促进甲状腺乳头状癌细胞进展。本课题拟通过细胞实验、分子生物学实验、临床样本分析，结合基因干扰、过表达等手段研究CPT1C对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学特性的调控作用，进一步阐明甲状腺乳头状癌的致病分子机制，为其早期诊断和治疗提供坚实的理论依据和潜在的药物靶点。
第一章 代谢应激条件下CPT1C表达与甲状腺乳头状癌细胞的存活关系研究
研究方法:
课题组应用临床收集的乳头状甲状腺癌临床样本，对CPT1C的核酸表达水平进行对比分析;同时在甲状腺癌细胞系中沉默CPT1C后检测甲状腺癌细胞的细胞活性、周期和凋亡情况;进一步构建应激模型，采用不同的应激刺激检测CPT1C的表达情况。
研究结果:
1、在48例患者中，34例(71％)患者肿瘤中的CPT1C mRNA表达量显著高于癌旁正常组织;
2、在乳头状甲状腺癌细胞系KTC-1中通过转染siRNA干扰CPT1C表达，发现沉默CPT1C后可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力，促进细胞凋亡的发生，并使G2/M期细胞比例降低，G1期细胞比例增加;
3、在低氧应激模型中，随着低氧时间的延长，KTC-1和B-CPAP细胞中CPT1C的表达逐渐升高;在低糖应激模型中，葡萄糖浓度的逐渐降低也导致KTC-1和B-CPAP细胞中CPT1C的表达逐渐升高;
4、干扰CPT1C后，细胞在缺氧和低糖情况下的存活率均明显降低;过表达CPT1C可显著提高细胞在缺氧和低糖情况下的存活率。
研究结论:
乳头状甲状腺癌癌组织的CPT1C mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织;CPT1C对甲状腺癌细胞增殖、迁移、凋亡等生物学特性具有重要调控作用;低氧、低糖等代谢应激可上调甲状腺癌细胞中CPT1C的表达水平;CPT1C对代谢应激下的甲状腺癌细胞的存活具有重要调节作用。
第二章 代谢应激下乳头状甲状腺癌细胞中CPT1C表达上调的分子机制研究
研究方法:
采用代谢应激模型，检测AMP激活的蛋白激酶-过氧化物酶体增殖激活物受体α(PPARα)通路（AMPK-PPARα）水平变化;结合AMPK特异性激动剂和抑制剂，研究AMPK在CPT1C上调中的作用。
研究结果:
1、在低糖环境下，与CPT1C表达量增加相一致，AMPK的活性（磷酸化AMPK水平）增加，PPARα的表达水平也明显增加;
2、AMPK激动剂AICAR可在显著提高细胞内p-AMPK水平的同时，浓度依赖性地上调细胞内CPTIC的表达水平;
3、AMPK抑制剂Compound C不仅抑制了细胞本底状态下AMPK的活性和PPARα、CPT1C的表达，还可在代谢应激条件下，显著抑制AMPK的激活和PPARα、CPT1C表达水平的升高。同时，AMPK抑制剂Compound C还更加促进了肿瘤细胞的凋亡，降低了肿瘤细胞的活性。
研究结论:
代谢应激下AMPK-PPARα通路的激活与CPT1C表达水平升高同步;CPT1C和PPARα表达水平升高可能依赖于AMPK的激活作用。
第三章 代谢应激下乳头状甲状腺癌细胞中PPARα对CPT1C表达的调控
研究方法:
用转染siRNA的方法干扰PPARα的表达，观察在本底和代谢应激状态下对CPT1C表达水平的影响;构建CPT1C荧光素酶报告基因质粒，观察PPARα是否可直接促进CPT1C的转录。
研究结果:
1、干扰PPARα表达后，无论是正常状态下，还是在低糖低氧的代谢应激下，细胞内CPTIC的表达水平均受到明显抑制;
2、干扰PPARα表达对细胞本底状态下凋亡的影响不大，但显著提高了代谢应激下凋亡细胞的比例，降低了肿瘤细胞的存活;
3、过表达PPARα可显著增加CPT1C启动子的转录活性。
研究结论:
代谢应激下，PPARα可以直接作用于CPT1C启动子，从转录水平上调控CPT1C的表达。