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目的:通过对比体外灌流前后的慢性重型肝炎患者血浆中的胆红素、胆汁酸、内毒素、细胞因子水平的变化,探讨血浆灌流对以上毒物的清除效果,并进一步观察体外灌流前后的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞株功能的影响及可能机制,以便了解血浆灌流对重型肝炎的治疗作用和机理,并为灌流材料的改进提供依据。
材料和方法:收集典型慢性重型肝炎患者的血浆(chronicseverehepatitisplasma,CSHP)1份,正常人血浆(normolhumanplasma,NHP)共12人次均匀混合成1份。C3A细胞株来自于首都医科大学附属北京佑安医院人工肝细胞生物研究中心。六种血浆灌流器分别来源于河北廊坊市爱尔血液净化器材厂的活性炭灌流器、胆红素吸附柱、树脂吸附器,天津市紫波高科技有限公司的树脂血浆灌流器,日本旭化成化学株式会社的活性炭灌流器,广东丽珠集团丽珠医用生物材料厂的树脂血液灌流器。将六种血浆灌流器的每一种均分为3个剂量组,即高剂量组(每12ml慢性重型肝炎患者的血浆中加入4克的灌流材料)、中剂量组(每12ml慢性重型肝炎患者的血浆中加入2克的灌流材料)、低剂量组(每12ml慢性重型肝炎患者的血浆中加入1克的灌流材料),进行体外血浆处理后,共测定18组血浆灌流后的慢性重型肝炎患者血浆(thehemoperfusionplasma,HPP)及CSHP中的胆红素、胆汁酸含量、内毒素浓度、细胞因子(IL-1α、IL-1β、HGF、EGF、TNF-α、TNF-β)浓度。选取六组HPP高剂量组、CSHP、NHP为培养基,以C3A细胞为观察对象:检测其在各种培养基中的第24小时、72小时、120小时的增殖活性、安定代谢量、GSH含量变化。
结果:1.同未行体外血浆灌流的慢性重型肝炎患者血浆(CSHP)相比,六组血浆灌流后的慢性重型肝炎患者血浆(HPP)中胆红素、胆汁酸、内毒素、细胞因子(IL-1α、IL-1β、HGF、EGF、TNF-α、TNF-β)均有下降,尤以高剂量组下降最明显。六组HPP的相同剂量组中,在清除胆红素、胆汁酸方面,广东丽珠集团丽珠医用生物材料厂的树脂灌流器效果高于其余组;在清除内毒素和细胞因子TNF-α、TNF-β、IL-1α方面,日本旭化成化学株式会社的活性炭灌流器效果高于其余组;在清除细胞因子IL-1β方面,河北廊坊市爱尔血液净化器材厂的胆红素吸附灌流器效果高于其余组;在保存细胞因子HGF、EGF方面,河北廊坊市爱尔血液净化器材厂的树脂吸附灌流器效果优于其余组。
2.对在100%CSHP培养的C3A细胞第24h、72h、120h进行MTT检测,各组血浆培养基中细胞的OD值随着时间的延长逐渐增加,三个时间点测得的OD值均高于六组100%HPP及100%NHP。六组100%HHP中有三组高于100%NHP、三组低于100%NHP,其中丽珠树脂灌流器高剂量灌流组、天津紫波树脂灌流器高剂量灌流组、日本旭化成活性炭灌流器高剂量灌流组中的第24h、72h、120h的C3A细胞OD值均高于100%NHP组;河北爱尔活性炭灌流器高剂量灌流组、河北爱尔树脂吸附器高剂量灌流组、河北爱尔胆红素吸附柱高剂量灌流组中的第24h、72h、120h的C3A细胞OD值均低于100%NHP组。
3.100%CSHP、六组100%HPP、100%NHP中的C3A细胞在连续培养24、72、120小时后,测定细胞内安定代谢量结果显示,各组血浆培养基中细胞的安定代谢量随着时间的延长逐渐增加。在第24h、72h、120h各时间点中,均为100%NHP中细胞代谢安定数量最多,六组100%HPP中细胞代谢安定数量高于100%CSHP;六组100%HPP中细胞代谢安定数量又有不同,代谢量由高自低分别为:日本旭化成活性炭灌流器灌流组、河北爱尔胆红素吸附柱灌流组、天津紫波树脂灌流器灌流组、河北爱尔树脂吸附器灌流组、河北爱尔活性炭灌流器灌流组、丽珠树脂灌流器灌流组。
4.100%CSHP、六组100%HPP、100%NHP中的C3A细胞在连续培养24、72、120小时后,测定细胞内GSH含量结果显示,各组血浆培养基随着时间的延长细胞内的GSH量逐渐减低。在第24h、72h、120h各时间点中,均为100%NHP中细胞内的GSH含量剩余最多,六组100%HPP中细胞内的GSH含量高于100%CSHP;六组100%HPP中细胞内的GSH含量又有不同,含量由高自低分别为日本旭化成活性炭灌流器灌流组、丽珠树脂灌流器灌流组、河北爱尔树脂吸附器灌流组、河北爱尔胆红素吸附柱灌流组、河北爱尔活性炭灌流器灌流组、天津紫波树脂灌流器灌流组。
结论:1.目前市场应用的活性炭及树脂灌流材料,均可以减少慢性重型肝炎患者血浆中诸如胆红素、胆汁酸、内毒素、细胞因子等有害物质,同时对促进肝细胞再生的因子也有清除作用。不同类型的灌流材料的作用有所不同,而且存在量效关系(吸附材料剂量与吸附能力存在正相关)。
2.C3A细胞在慢性重型肝炎患者血浆中增殖情况良好。在经过血浆灌流吸附后的慢性重型肝炎患者血浆中培养,细胞增殖能力有所下降,而且不同灌流材料处理的血浆对C3A细胞增殖影响的程度有所不同。原因可能与血液灌流清除了促进肝细胞再生的因子有关。
3.慢性重型肝炎患者血浆经过血浆灌流处理后,培养在其中的C3A细胞的安定代谢量与谷胱甘肽量同灌流前相比有所增加,但仍低于正常人血浆。提示血液灌流通过清除慢性重型肝炎血浆毒素,可改善肝细胞解毒功能。