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镉对哺乳动物有多种毒性作用,已被证实具有致癌性,而且动物实验和对镉曝露人群调查证实,镉对肝脏,肾脏,肺,精巢,前列腺,心脏,骨骼系统,神经系统和免疫系统都有毒害作用。但是由于镉的毒性作用与其他辅因子有关,所以对镉本身的毒性机理还不是很清楚。本实验旨在对镉毒性及致癌机理进行初步的研究,并优化斑马鱼肌肉蛋白二维电泳的条件。 主要研究内容与结果如下: (1)蛋白二维电泳的分离条件优化:使用尿素裂解液或尿素硫脲裂解液处理蛋白样品,都能较好的裂解蛋白样品;采用丙酮沉淀处理蛋白样品方法,比不用丙酮沉淀处理样品,能显著减少提取蛋白的盐离子含量;pH3-10的胶条不能很好的分离斑马鱼的肌肉组织蛋白,而选用pH5-8的胶条能较好的分离斑马鱼肌肉组织蛋白质。 (2)用TOF-TOF质谱鉴定了镉曝露斑马鱼肌肉差异表达蛋白点:镉曝露斑马鱼肌肉蛋白中肌酸激酶蛋白(CK,蛋白点1)、肌球蛋白轻链蛋白3(MLC3,蛋白点2)、腺苷酸激酶蛋白(AK1,蛋白点5)表达量上升,慢性肌球蛋白重链蛋白1(SMHC1,蛋白点6)、Rho谷胱甘肽S转移酶(Rho-GST,蛋白点8)、内固醇合成急性调控蛋白(StAR,蛋白点9)和Ras相关蛋白Rab32(Rab32,蛋白点10)表达量下降。肌酸激酶蛋白、肌球蛋白轻链蛋白、腺苷酸激酶、慢肌球蛋白重链蛋白都参与ATP代谢。肌肉收缩需要大量ATP,肌酸激酶、腺苷酸激酶、肌球蛋白轻链蛋白3、以及慢性肌球蛋白重链蛋白1等这些蛋白受到影响,可能会影响斑马鱼的行为。 (3)荧光定量PCR和Western blot检测表明,镉曝露能诱导斑马鱼肌肉组织肌酸激酶和腺苷酸激酶的mRNA水平和蛋白表达水平的提高,肌酸激酶和腺苷酸激酶的酶活水平略微提高,但变化不明显。表明斑马鱼可能以某种机制维持能量代谢的平衡。 (4)镉能激活结肠癌SW480细胞MEK/ERK信号通路,引起与细胞凋亡和DNA损伤修复相关的Mdm2和p53以及p21表达上调,参与细胞周期调控的Cyclin D1和Survivin的蛋白表达上调,但与DNA复制和细胞增殖相关的PCNA却受到抑制;与免疫反应和脂肪代谢关系密切的PPARα和PPARγ蛋白表达水平上调的情况。 (5)流式检测结果显示30μM镉曝露处理SW480细胞,不能显著改变细胞周期,但24小时后,SW480细胞开始出现凋亡迹象;划痕试验表明30μM镉能抑制SW480细胞的迁移及增殖能力。