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目的:探讨超声靶向微泡破碎技术介导miRNA-378在小鼠心肌组织内特异性表达的方法.
方法:构建带有绿色荧光免疫蛋白标签的miRNA-378质粒,将其与超声造影剂Vevo MicroMarker(VisualSonics Inc,Catalog VS-11694)偶联并进行效率检测,确定两者最佳混合比例后,以雄性成年C57/BL6小鼠心脏作为靶组织实施UTMD.使用Seqoia 512(SIEMENS,German)超声诊断仪,15L8探头.6只小鼠经尾静脉先后注入3种不同剂量的造影剂微泡(50,100,200μL/20g BW),采用低机械指数下(MI:0.2)的实时超声造影记录小鼠左室心腔内信号强度,每次连续记录10分钟,注射间隔时间20分钟,应用TomTec超声造影分析软件绘制时间-强度曲线,得到不同浓度下信号饱和曲线,确定最佳注射剂量.经小鼠尾静脉注入"Vevo微泡+miR-378质粒载体"混悬液(设置注射生理盐水、单独注射Vevo微泡和单独注射miR-378表达载体对照组,每组6只小鼠),通过二维超声获得心脏短轴切面,采用探头发射频率8MHz,MI:1.7,触发频率1次/2000ms,破碎时间20min进行UTMD,同步记录左心腔内造影信号强度,应用TomTec超声造影分析软件绘制时间-强度曲线,得到微泡信号衰减情况.于UTMD术后2天处死小鼠,开胸后经心尖部注入4％多聚甲醛进行灌流固定,取心脏组织按常规进行石蜡包埋并切片,用原位杂交法检测miRNA-378分布的细胞类型、特点及表达量高低,并用荧光显微镜术检测GFP的表达水平,并与对照组进行比较.
结果:Vevo微泡+miR-378质粒载体+超声破碎组心腔内超声造影时间强度曲线中,微泡浓度随照射时间延长而逐渐减低,荧光显微镜下可见GFP在心肌表达,右室心肌优于左室.生理盐水、Vevo微泡组未见明显GFP表达,miR-378质粒载体组心肌可见少量GFP表达,但均明显少于实验组,差异具有统计学差异.
结论:超声靶向微泡破碎技术能有效介导miRNA-378在C57/BL6小鼠心脏中高表达,为进一步研究如何高效、组织定向性地干预miRNA的表达提供了依据.