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目的：克隆人端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)及癌胚抗原启动子(CEAp)的序列片段,并比较hTERT、CEA及CMV启动子在人结肠癌细胞株lovo、SW480中的启动效率。
方法：设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆人端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)及癌胚抗原启动子(CEAp),经测序无误后,选择pLVX-EGFP-3FLAG为原始表达载体,选取酶切位点MluⅠ和XhoⅠ,联合双酶切和PCR方法切除原始载体中巨细胞病毒启动子(CMV),将上述启动子片段与pLVX-EGFP-3FLAG载体重组,构建出携带人端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)和癌胚抗原启动子(CEAp)的重组质粒pLVX-CEAp-EGFP-3FLAG和pLVX-hTERTp-EGFP-3 FLAG,将上述两种质粒连同原始表达载体pLVX-EGFP-3FLAG(含CMV启动子)分别瞬时转染人结肠癌细胞株lovo、SW480,检测两种细胞株的荧光表达强度。
结果：琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长度为327bp, DNA测序结果与GenBank(AN 097365)中hTERT启动子DNA序列完全一致；同样方法克隆的CEA启动子片段长度为369bp,DNA测序结果与GenBank (NT O11109)中CEA启动子DNA序列完全一致。将上述克隆片段连接到不含CMV启动子的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG上，双酶切、PCR鉴定及DNA序列分析无误。将 pLUX-CEAp-EGFP-3FLAG , pLVX-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-EGFP-3FLAG分别瞬时转染人结肠癌细胞lovo, SW480，示：在lovo细胞中：CMV启动子的启动效率约为54.7％, HTERT启动子的启动效率约为33.0％, CEA启动子的启动效率约为9.5％；在SW480中：CMV启动子的启动效率约为16.5％, HTERT启动子的启动效率约为10.1％, CEA启动子的启动效率约为8.5％，在上述两种细胞中，三种启动子的启动效率差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：在人结肠癌细胞株lovo, SW480中，CMV启动子的启动效率最高，HTER7，启动子启动效率次之，CEA启动子启动效率最低。
方法：设计引物应用PCR法从人结肠癌基因组中克隆人端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)及癌胚抗原启动子(CEAp),经测序无误后,选择pLVX-EGFP-3FLAG为原始表达载体,选取酶切位点MluⅠ和XhoⅠ,联合双酶切和PCR方法切除原始载体中巨细胞病毒启动子(CMV),将上述启动子片段与pLVX-EGFP-3FLAG载体重组,构建出携带人端粒酶催化亚单位启动子(hTERTp)和癌胚抗原启动子(CEAp)的重组质粒pLVX-CEAp-EGFP-3FLAG和pLVX-hTERTp-EGFP-3 FLAG,将上述两种质粒连同原始表达载体pLVX-EGFP-3FLAG(含CMV启动子)分别瞬时转染人结肠癌细胞株lovo、SW480,检测两种细胞株的荧光表达强度。
结果：琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长度为327bp, DNA测序结果与GenBank(AN 097365)中hTERT启动子DNA序列完全一致；同样方法克隆的CEA启动子片段长度为369bp,DNA测序结果与GenBank (NT O11109)中CEA启动子DNA序列完全一致。将上述克隆片段连接到不含CMV启动子的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG上，双酶切、PCR鉴定及DNA序列分析无误。将 pLUX-CEAp-EGFP-3FLAG , pLVX-hTERTp-EGFP-3FLAG及pLVX-EGFP-3FLAG分别瞬时转染人结肠癌细胞lovo, SW480，示：在lovo细胞中：CMV启动子的启动效率约为54.7％, HTERT启动子的启动效率约为33.0％, CEA启动子的启动效率约为9.5％；在SW480中：CMV启动子的启动效率约为16.5％, HTERT启动子的启动效率约为10.1％, CEA启动子的启动效率约为8.5％，在上述两种细胞中，三种启动子的启动效率差异有统计学意义(P<0.05)。
结论：在人结肠癌细胞株lovo, SW480中，CMV启动子的启动效率最高，HTER7，启动子启动效率次之，CEA启动子启动效率最低。