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摘要：目前，酶联免疫吸附法（ELISA）是最为常用的感染性标志物检测手段，其测定结果的准确、可靠性直接影响到临床诊断及治疗效果，在临床实际操作过程中，常常会由于仪器、试剂、工作人员操作等方面的原因而影响ELISA测定结果。为进一步提高ELISA测定结果的准确性，本文主要分析了临床实践中常见的几种问题及其原因，为临床实践提供重要的参考依据。
关键词：ELISA测定；常见问题；原因分析
【中图分类号】
R45 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0254-01
ELISA测定的主要原理是利用抗原、抗体之间的特异反应通过某一种或几种酶来连接待测物，通过底物和酶的相互作用，会改变溶液的颜色，进而通过观察溶液颜色来判定测定的结果[1]。在医院检验科，ELISA是最为常用，也是最为重要的一种感染性标志物检测方法，笔者主要结合自己多年的经验，针对ELISA测定实践中存在的常见问题及其发生原因进行剖析，具体分析如下。
1 常见问题
在医院检验科进行ELISA测定过程中，常常会碰到整板显色、白板、无法检测出弱阳性质控样本以及测定重复性较差等问题。①整板显色主要表现在没有彻底清洁洗板，污染了洗液，进而导致显色液毁坏、变质，或者是加反酶结合物，通常这种问题主要存在于HBsAb、HBsAg测定中。②白板主要是指整板无色，也将阳性对照包括在内，比如像洗液中存在酶抑制剂，酶结合物漏加，显色剂漏加A或B。或者是将终止剂当做显色剂用。③无法检测出弱阳性质控样本。比如显色时间不足，不能准确判定样本测定结果；或者是温度没有达标，温育时间不足等。④测定重复性较差。具体指标本处理方法不对，没有正确处理酶标仪滤光片，混合应用不同批号的试剂组，微板孔条受到污染，显色时间、洗板时间、温育时间协调不一，样本加错，样本添加不准确。
2 常见的问题原因分析
2.1 假阴性出现的原因分析及建议：
导致假阴性的原因主要包括以下几种情况，①如果检测大批量样本，实验室检测人员的工作量比较大，有时候可能观察样本呈色不及时，很多样本在实验者观察时，结果已经褪色，导致样本呈现假阴性。②试剂自身的质量并没有达标，比如已经过了保质期，试剂保存的方法不恰当，在试剂运输的过程中，破坏了样本，蒸馏质存在其他混合物。如果缺乏阴阳对比，极易出现假阴性。③温育、温度不充分，作用时间过短，忘记添加底物显色剂或者酶标二抗等，这些原因都可能导致出现假阴性。④部分生产试剂厂家经济条件较差，仪器、设备等比较落后，特别是若为人工包被的话，和普通试剂相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出现“漏包”、抗体（抗原）失去活性或活性不足等现象，进而出现假阴性。⑤在检测的过程中，加样技术非常重要，由于ELISA 测定法仅仅是微量样品，如果多加1ul样品或者少加1ul样品，极易导致检测标本的测定结果一时阳性，一时阴性。
目前，很多厂家为了增加视觉的直观性，更加容易区分样本的阴阳性，常常会利用浓度较高、阳性较强的对照作为阴阳对照的参考，这样的后果是在肉眼观察样本测定结果的过程中，极易出现模棱两可的局面而无法直接判断出结果，必须在酶标仪的辅助下才可以准确判读结果。但是由于酶标仪的灵敏度较低，重复性良好，可能有5%左右试剂盒阳性率会漏掉。因此笔者认为，临床在HBsAg 检测过程中，同时也应该检测1 IU/ml 的临界值血清。在样品中不要添加Na2N3，避免酶活力受到抑制。且建议在医院检验科应配备洗板机，避免出现洗板次数过多、冲力过大、浸泡过长等影响样本检测正确性的现象。
2.2 样本假阳性的原因分析及其建议：
导致样本出现假阳性的原因主要包括以下几种情况：
2.2.1 吸附作用。很多SLE或者类风湿等具有自身免疫疾病患者，他们的血清中常常会存一些特殊组成成分对样本测定的结果准确性造成影响，比如在包被板上会轻微吸附着一些IgG 抗体，这些附着的IgG抗体会导致之前显示阴性样本显色，这种情况显然是失真的。如果遇到这种情况建议结合样本具体情况进行判断，并且应该在样本测定结果中标注特殊情况。
2.2.2 标本中杂质的影响。在检测标本中，如果血液样本黏稠度过高，血清脂质含量、胆红素含量、血红蛋白含量等过高，都会干扰ELISA测定结果，出现假阳性结果。
2.2.3 内源性物质。据相关数据统计[3]，大约有40%左右的学者认为样本血清中都存在某些对ELISA测定结果存在交叉反应物质、医源性诱导抗鼠Ig（s）抗体、嗜异性抗体、补体、类风湿因子或者其他干扰作用物质等，在一定程度上会干扰样本测定结果的准确性，会导致样本检测结果出现假阳性。
2.2.4 外源性物质。在采集样本和保存样本的过程中，常常会由于实验室操作人员操作不规范而导致样本测定结果出现假阳性。比如：①样本溶血现象。这种问题常常是由于人为操作因素所致，在破坏溶解红细胞过程中会产生大量血红蛋白，ELISA的标记主要以辣根过氧化物酶为主，而这些血红蛋白的过氧化物酶活性较强，因此一旦采集标本出现溶血现象，会出现非特异性显色反应，导致样本检测出现假阳性现象。因此临床检验实践中应重视标本溶血问题。②保存标本的方法不恰当，如果存放存标本的时间在1d以上，则很容易导致标本活性丧失或大大降低，出现假阴性问题。如果标本待检时间过长，标本血清中IgG 抗体极易形成多聚体，而AFP抗体极易形成二聚体，二聚体和多聚体相互结合极易导致本底过深，进而使样本测定结果出现假阳性。因此在临床检测过程中，应该在最短的时间内进行ELISA 测定，如果由于特殊情况必须将测定时间延长，则应该将标本存放环境设定为4℃恒温（5d内）。若标本在7d后检测，应采取低温冷冻处理，在检测前再测解冻，并轻轻充分摇匀后测定。
2.2.5 并没有全面凝集标本。由于血液采集后在30min-2h后逐渐开始凝固，在24h左右会完全凝固，因此在ELISA 检测过程中，常常会在血液标本中适当添加一些促凝剂或抗凝剂，为了争取有效的检测时间会强行将血清分离出来。此时血清中仍然有部分纤维蛋白原残留，并极易形成纤维蛋白块，这些肉眼可见的纤维蛋白块会使实验者判断失误，导致样本测定出现假阳性。这种问题其实比较好解决，导致这种现象的主要原因是血液还没有完全凝固所致，临床检测时只需要待血液完全凝固后分离血清即可。如果特殊情况下需要快速检测，则应该使用分离胶采血管或者加入一定量促凝剂。
2.3 检测操作误差： ELISA 测定基本上都是手工操作，会无可避免的存在某些误差，如果样品加入时间，加入试剂以及混合时间存在出入，极易造成操作时差。在操作过程中，应在加样后轻轻混合均匀，不能混用不同批号试剂，试剂瓶和试剂盖应仔细检查，避免出现张冠李戴现象。应确保试剂保存的温度、保存时间、洗涤方法、显色条件等保持一致，在检测时应注意避免试剂、样本、板以及吸头污染。若在阈值附近出现检测结果时阴时阳现象，不要急于做出判断，应重复多次进行检测，最终的检测结果应以偶数结果为判定标准。
根据以上常见问题及其原因的分析，主要存在样本测定结果假阴性、假阳性等问题，应综合考虑人为操作因素、试剂因素、标本因素等多方面影响，及早查明影响ELISA 测定的根本原因，并及时纠正进行重新测定，确保ELISA 测定结果的准确性、可靠性，为临床提供科学依据。
参考文献
[1] 谭爱华.ELISA 法检测中应注意的问题[J].实用医技杂志，2012，15（19）：2496.
[2] 周先碗，胡晓倩.生物化学仪器分析与实验技术[M].北京：化学工业出版社，2012：274.
关键词：ELISA测定；常见问题；原因分析
【中图分类号】
R45 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）07-0254-01
ELISA测定的主要原理是利用抗原、抗体之间的特异反应通过某一种或几种酶来连接待测物，通过底物和酶的相互作用，会改变溶液的颜色，进而通过观察溶液颜色来判定测定的结果[1]。在医院检验科，ELISA是最为常用，也是最为重要的一种感染性标志物检测方法，笔者主要结合自己多年的经验，针对ELISA测定实践中存在的常见问题及其发生原因进行剖析，具体分析如下。
1 常见问题
在医院检验科进行ELISA测定过程中，常常会碰到整板显色、白板、无法检测出弱阳性质控样本以及测定重复性较差等问题。①整板显色主要表现在没有彻底清洁洗板，污染了洗液，进而导致显色液毁坏、变质，或者是加反酶结合物，通常这种问题主要存在于HBsAb、HBsAg测定中。②白板主要是指整板无色，也将阳性对照包括在内，比如像洗液中存在酶抑制剂，酶结合物漏加，显色剂漏加A或B。或者是将终止剂当做显色剂用。③无法检测出弱阳性质控样本。比如显色时间不足，不能准确判定样本测定结果；或者是温度没有达标，温育时间不足等。④测定重复性较差。具体指标本处理方法不对，没有正确处理酶标仪滤光片，混合应用不同批号的试剂组，微板孔条受到污染，显色时间、洗板时间、温育时间协调不一，样本加错，样本添加不准确。
2 常见的问题原因分析
2.1 假阴性出现的原因分析及建议：
导致假阴性的原因主要包括以下几种情况，①如果检测大批量样本，实验室检测人员的工作量比较大，有时候可能观察样本呈色不及时，很多样本在实验者观察时，结果已经褪色，导致样本呈现假阴性。②试剂自身的质量并没有达标，比如已经过了保质期，试剂保存的方法不恰当，在试剂运输的过程中，破坏了样本，蒸馏质存在其他混合物。如果缺乏阴阳对比，极易出现假阴性。③温育、温度不充分，作用时间过短，忘记添加底物显色剂或者酶标二抗等，这些原因都可能导致出现假阴性。④部分生产试剂厂家经济条件较差，仪器、设备等比较落后，特别是若为人工包被的话，和普通试剂相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出现“漏包”、抗体（抗原）失去活性或活性不足等现象，进而出现假阴性。⑤在检测的过程中，加样技术非常重要，由于ELISA 测定法仅仅是微量样品，如果多加1ul样品或者少加1ul样品，极易导致检测标本的测定结果一时阳性，一时阴性。
目前，很多厂家为了增加视觉的直观性，更加容易区分样本的阴阳性，常常会利用浓度较高、阳性较强的对照作为阴阳对照的参考，这样的后果是在肉眼观察样本测定结果的过程中，极易出现模棱两可的局面而无法直接判断出结果，必须在酶标仪的辅助下才可以准确判读结果。但是由于酶标仪的灵敏度较低，重复性良好，可能有5%左右试剂盒阳性率会漏掉。因此笔者认为，临床在HBsAg 检测过程中，同时也应该检测1 IU/ml 的临界值血清。在样品中不要添加Na2N3，避免酶活力受到抑制。且建议在医院检验科应配备洗板机，避免出现洗板次数过多、冲力过大、浸泡过长等影响样本检测正确性的现象。
2.2 样本假阳性的原因分析及其建议：
导致样本出现假阳性的原因主要包括以下几种情况：
2.2.1 吸附作用。很多SLE或者类风湿等具有自身免疫疾病患者，他们的血清中常常会存一些特殊组成成分对样本测定的结果准确性造成影响，比如在包被板上会轻微吸附着一些IgG 抗体，这些附着的IgG抗体会导致之前显示阴性样本显色，这种情况显然是失真的。如果遇到这种情况建议结合样本具体情况进行判断，并且应该在样本测定结果中标注特殊情况。
2.2.2 标本中杂质的影响。在检测标本中，如果血液样本黏稠度过高，血清脂质含量、胆红素含量、血红蛋白含量等过高，都会干扰ELISA测定结果，出现假阳性结果。
2.2.3 内源性物质。据相关数据统计[3]，大约有40%左右的学者认为样本血清中都存在某些对ELISA测定结果存在交叉反应物质、医源性诱导抗鼠Ig（s）抗体、嗜异性抗体、补体、类风湿因子或者其他干扰作用物质等，在一定程度上会干扰样本测定结果的准确性，会导致样本检测结果出现假阳性。
2.2.4 外源性物质。在采集样本和保存样本的过程中，常常会由于实验室操作人员操作不规范而导致样本测定结果出现假阳性。比如：①样本溶血现象。这种问题常常是由于人为操作因素所致，在破坏溶解红细胞过程中会产生大量血红蛋白，ELISA的标记主要以辣根过氧化物酶为主，而这些血红蛋白的过氧化物酶活性较强，因此一旦采集标本出现溶血现象，会出现非特异性显色反应，导致样本检测出现假阳性现象。因此临床检验实践中应重视标本溶血问题。②保存标本的方法不恰当，如果存放存标本的时间在1d以上，则很容易导致标本活性丧失或大大降低，出现假阴性问题。如果标本待检时间过长，标本血清中IgG 抗体极易形成多聚体，而AFP抗体极易形成二聚体，二聚体和多聚体相互结合极易导致本底过深，进而使样本测定结果出现假阳性。因此在临床检测过程中，应该在最短的时间内进行ELISA 测定，如果由于特殊情况必须将测定时间延长，则应该将标本存放环境设定为4℃恒温（5d内）。若标本在7d后检测，应采取低温冷冻处理，在检测前再测解冻，并轻轻充分摇匀后测定。
2.2.5 并没有全面凝集标本。由于血液采集后在30min-2h后逐渐开始凝固，在24h左右会完全凝固，因此在ELISA 检测过程中，常常会在血液标本中适当添加一些促凝剂或抗凝剂，为了争取有效的检测时间会强行将血清分离出来。此时血清中仍然有部分纤维蛋白原残留，并极易形成纤维蛋白块，这些肉眼可见的纤维蛋白块会使实验者判断失误，导致样本测定出现假阳性。这种问题其实比较好解决，导致这种现象的主要原因是血液还没有完全凝固所致，临床检测时只需要待血液完全凝固后分离血清即可。如果特殊情况下需要快速检测，则应该使用分离胶采血管或者加入一定量促凝剂。
2.3 检测操作误差： ELISA 测定基本上都是手工操作，会无可避免的存在某些误差，如果样品加入时间，加入试剂以及混合时间存在出入，极易造成操作时差。在操作过程中，应在加样后轻轻混合均匀，不能混用不同批号试剂，试剂瓶和试剂盖应仔细检查，避免出现张冠李戴现象。应确保试剂保存的温度、保存时间、洗涤方法、显色条件等保持一致，在检测时应注意避免试剂、样本、板以及吸头污染。若在阈值附近出现检测结果时阴时阳现象，不要急于做出判断，应重复多次进行检测，最终的检测结果应以偶数结果为判定标准。
根据以上常见问题及其原因的分析，主要存在样本测定结果假阴性、假阳性等问题，应综合考虑人为操作因素、试剂因素、标本因素等多方面影响，及早查明影响ELISA 测定的根本原因，并及时纠正进行重新测定，确保ELISA 测定结果的准确性、可靠性，为临床提供科学依据。
参考文献
[1] 谭爱华.ELISA 法检测中应注意的问题[J].实用医技杂志，2012，15（19）：2496.
[2] 周先碗，胡晓倩.生物化学仪器分析与实验技术[M].北京：化学工业出版社，2012：274.