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摘要 从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到12株纤维素降解茵，从中筛选出一株高效降解茵(X10)，研究其最适宜的培养条件为：配制以葡萄糖 微晶纤维素(1：1)为碳源、以蛋白胨 牛肉膏(1：1)为氮源的培养基，pH值7.5，30℃下培养40h，测得纤维素降解酶酶活可达到67.44U。通过对其16srRNA测序鉴定，该菌与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)有99％的同源性。纤维素降解菌的选育可为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源。
关键词 纤维素降解茵；筛选；鉴定；酶活
中图分类号 093-331 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)02-0034-02
纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生天然碳水化合物，其主要存在于秸秆、木材等高等植物的细胞壁中，每年通过光合作用可生产纤维素逾10亿t。然而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。目前，降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤维素。因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效降解纤维素的前提条件。该研究从土壤中筛选降解纤维素的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合理利用提供一定的资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品来源。样品取自重庆市缙云山落叶覆盖的腐殖层土壤。
1.1.2 培养基。LB培养基、刚果红培养基、羧甲基纤维素培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 纤维素降解菌的初筛和纯化。纤维素降解菌的初筛和纯化按照卢月霞等的方法进行。
1.2.2 纤维素降解菌的复筛。分别将纯化后的单菌落点样于刚果红培养基中，每个平板点1个菌种，且只点3个样，降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小可以直接反应纤维素酶活的相对大小。因此，筛选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落，即为纤维素高效降解菌，用CMC培养基作斜面培养，4℃保存。
1.2.3 16srRNA测序。使用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对纤维素降解菌进行基因DNA提取，以此为模板，以通用引物8F和1495R进行PCR扩增16srRNA。PCR体系为：D.W14.5μL，Buffer(Mg2 free)2.5μL，Mg2 1.5μL，dNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板2μL，Taq酶2U。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环，扩增结束后72℃延伸10min。扩增后的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳(100V,30min)进行分析，将在1000-2000bp出现较亮条带的样品送去宝生物公司进行测序。
1.2.4 纤维素酶酶活的测定。按照李慧君等的方法进行粗酶的提取，同时通过DNS显色检测酶活，葡萄糖标准曲线的绘制以及酶活的检测具体操作参照GB20287-2006。酶活力单位(U)：1mL原样酶液，1min产生1μg葡萄糖定义为
1 个酶活力单位。
1.2.5 降解菌培养条件的优化。研究不用培养温度、pH值、碳源、氮源对其产酶的影响，并在各因子最适条件下培养该菌，检测其产酶酶活。
2 结果与分析
2.1 纤维素降解菌的筛选与纯化
经过初筛，得到12株具有降解能力的菌株，再经过复筛得到5株较强降解能力的菌株，其中以菌株X10的降解能力最强，初步判断该菌为纤维素降解菌。菌株XIO点样培养后透明降解圈如图1所示(经过1mol/LHCI处理呈蓝紫色)，测定其D：d=2：21。
2.4 降解菌培养条件的优化
2.4.1 培养温度对产酶的影响。将菌株X10分别接种于5个150ml的羧甲基纤维素培养基中，并分别在25、30、35、40、45℃下培养，40h后，测定定其CMC酶活，结果如图3所示。可以看出，当温度为30℃时，酶活最高。因此，30℃为该菌产酶的最适温度。
2.4.4 不同氮源对产酶的影响。分别以0.12％的蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨 牛肉膏、NH4NO4、(NH4)2SO4、NH4cl、酵母浸粉 NH4NO3、尿素为氮源，添加量均为0.2％，培养菌株。40h后，测定其CMC酶活，结果如图6所示。可以看出，该菌对有机氮的利用强于对无机氮的利用。在有机氮源中以蛋白胨 牛肉膏组合为最佳，同时发现无机氮中以尿素最差，其酶活为0，可见，尿素对该菌产酶或生长可能也具有抑制作用，因此，该菌产酶的最适氮源为蛋白胨 牛肉膏复合组合。
2.5 在最适条件下培养该菌
根据以上结果，配制以葡萄糖 微晶纤维素(1：1)为碳源，以蛋自胨 牛肉膏(1：1)为氮源的培养基，pH值7.5，并在最适温度30℃的条件下培养40h，测得其酶活达到了67.44U。
3 结论
通过对落叶腐殖质层土壤进行富集筛选，筛到12株具有降解纤维素功能的菌株，并以降解能力最强的X10菌株作为研究对象，进行分子鉴定以及产酶优化，最后以各因子最佳的优化培养基培养X10菌株，测得其CMC酶活可达67.44u。该菌经过测序鉴定为氧化微杆菌属，目前多有研究表明该属细菌具有降解多环芳烃化合物及脱硫能力，但很少有文章显示该属具有降解纤维素的能力。在试验过程中发现该菌生长较快，40h即可到达稳定期，其酶活也到达最大值。相比之下，该菌纤维素降解酶酶活较高。若进一步诱导，可能获得具有更高酶活的菌株，用以发酵产酶，可以节约发酵时间，提高产量。
关键词 纤维素降解茵；筛选；鉴定；酶活
中图分类号 093-331 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)02-0034-02
纤维素是自然界中储存量最大、分布最广泛的可再生天然碳水化合物，其主要存在于秸秆、木材等高等植物的细胞壁中，每年通过光合作用可生产纤维素逾10亿t。然而纤维素难以降解，导致其利用具有一定的局限性。目前，降解纤维素最有效、最经济的方法是生物降解法，即通过细菌、放线菌以及真菌等生物产生的纤维素酶来催化降解纤维素。因此，寻找和驯化产生高效纤维素酶的微生物是有效降解纤维素的前提条件。该研究从土壤中筛选降解纤维素的菌株，并对其产酶条件进行研究，以为纤维素的降解和合理利用提供一定的资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品来源。样品取自重庆市缙云山落叶覆盖的腐殖层土壤。
1.1.2 培养基。LB培养基、刚果红培养基、羧甲基纤维素培养基。
1.2 试验方法
1.2.1 纤维素降解菌的初筛和纯化。纤维素降解菌的初筛和纯化按照卢月霞等的方法进行。
1.2.2 纤维素降解菌的复筛。分别将纯化后的单菌落点样于刚果红培养基中，每个平板点1个菌种，且只点3个样，降解圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小可以直接反应纤维素酶活的相对大小。因此，筛选降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落，即为纤维素高效降解菌，用CMC培养基作斜面培养，4℃保存。
1.2.3 16srRNA测序。使用小量细菌基因组DNA抽提试剂盒对纤维素降解菌进行基因DNA提取，以此为模板，以通用引物8F和1495R进行PCR扩增16srRNA。PCR体系为：D.W14.5μL，Buffer(Mg2 free)2.5μL，Mg2 1.5μL，dNTP2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板2μL，Taq酶2U。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环，扩增结束后72℃延伸10min。扩增后的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳(100V,30min)进行分析，将在1000-2000bp出现较亮条带的样品送去宝生物公司进行测序。
1.2.4 纤维素酶酶活的测定。按照李慧君等的方法进行粗酶的提取，同时通过DNS显色检测酶活，葡萄糖标准曲线的绘制以及酶活的检测具体操作参照GB20287-2006。酶活力单位(U)：1mL原样酶液，1min产生1μg葡萄糖定义为
1 个酶活力单位。
1.2.5 降解菌培养条件的优化。研究不用培养温度、pH值、碳源、氮源对其产酶的影响，并在各因子最适条件下培养该菌，检测其产酶酶活。
2 结果与分析
2.1 纤维素降解菌的筛选与纯化
经过初筛，得到12株具有降解能力的菌株，再经过复筛得到5株较强降解能力的菌株，其中以菌株X10的降解能力最强，初步判断该菌为纤维素降解菌。菌株XIO点样培养后透明降解圈如图1所示(经过1mol/LHCI处理呈蓝紫色)，测定其D：d=2：21。
2.4 降解菌培养条件的优化
2.4.1 培养温度对产酶的影响。将菌株X10分别接种于5个150ml的羧甲基纤维素培养基中，并分别在25、30、35、40、45℃下培养，40h后，测定定其CMC酶活，结果如图3所示。可以看出，当温度为30℃时，酶活最高。因此，30℃为该菌产酶的最适温度。
2.4.4 不同氮源对产酶的影响。分别以0.12％的蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨 牛肉膏、NH4NO4、(NH4)2SO4、NH4cl、酵母浸粉 NH4NO3、尿素为氮源，添加量均为0.2％，培养菌株。40h后，测定其CMC酶活，结果如图6所示。可以看出，该菌对有机氮的利用强于对无机氮的利用。在有机氮源中以蛋白胨 牛肉膏组合为最佳，同时发现无机氮中以尿素最差，其酶活为0，可见，尿素对该菌产酶或生长可能也具有抑制作用，因此，该菌产酶的最适氮源为蛋白胨 牛肉膏复合组合。
2.5 在最适条件下培养该菌
根据以上结果，配制以葡萄糖 微晶纤维素(1：1)为碳源，以蛋自胨 牛肉膏(1：1)为氮源的培养基，pH值7.5，并在最适温度30℃的条件下培养40h，测得其酶活达到了67.44U。
3 结论
通过对落叶腐殖质层土壤进行富集筛选，筛到12株具有降解纤维素功能的菌株，并以降解能力最强的X10菌株作为研究对象，进行分子鉴定以及产酶优化，最后以各因子最佳的优化培养基培养X10菌株，测得其CMC酶活可达67.44u。该菌经过测序鉴定为氧化微杆菌属，目前多有研究表明该属细菌具有降解多环芳烃化合物及脱硫能力，但很少有文章显示该属具有降解纤维素的能力。在试验过程中发现该菌生长较快，40h即可到达稳定期，其酶活也到达最大值。相比之下，该菌纤维素降解酶酶活较高。若进一步诱导，可能获得具有更高酶活的菌株，用以发酵产酶，可以节约发酵时间，提高产量。