【摘 要】
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目的 探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨
【机 构】
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桂林医学院附属医院四肢创伤骨科 广西桂林 541000
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目的 探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响.方法 通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代.取第3代BMSCs,分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因(B组)、NGF过表达基因(C组)、沉默P75NTR和NGF过表达双基因(D组)转染,以未转染细胞作为对照(A组).转染7d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8d细胞的活性;Western blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达.倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况.将上述4组转染后BMSCs分别与DBM共培养制备组织工程骨后,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达.结果 转染7dA组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70％左右.Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P＜0.05).随时间推移,各组细胞增殖活性均上升,其中D组上升最明显,3～8d细胞活性明显高于A组(P＜0.05).倒置相差显微镜和扫描电镜观察示,BMSCs能与DBM形成良好黏附.皮下异位成骨实验中,HE染色示术后4、8周,D组比其余3组有更多的骨组织形成.ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达.实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN mRNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 沉默P75NTR联合NGF过表达双基因共转染BMSCs复合DBM构建组织工程骨具有良好的异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生.
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