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摘要：利用生物信息学方法对牛DAZL基因的一级结构和同源性进行分析，并根据牛DAZL基因序列设计引物来克隆该基因，通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体，成功克隆到了DAZL基因。生物信息学分析结果显示，哺乳动物的DAZL基因同源性很高。此外，构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-DAZL。
关键词：DAZL基因；序列；克隆；表达载体
中图分类号： S823.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0034-03
收稿日期：2014-03-21
基金项目：黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室开放课题（编号：GXZDSYS-2012-07）；东北农业大学博士启动基金（编号：2012RCB27）。
作者简介：郑鹏（1979—），男，黑龙江兰西人，博士，讲师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail：zh-96128@163.com。
通信作者：张贵学，博士，教授，博士生导师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail： gxzhang@neau.edu.cn。Deleted in azoospermia like （DAZL）基因是DAZ基因家族中的一员，最早克隆于蝇类的睾丸组织，是一个在进化上高度保守的基因，在脊椎动物的生殖细胞中特异表达，是生殖细胞形成所必须的调控因子。DAZL通过RNA识别基序与mRNA结合，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用[1]。DAZL基因是BOULE基因通过基因修饰、倍增而来，广泛分布于人类、鼠、爪蟾、蝾螈、斑马鱼、青鱼等物种中[2]。许多物种的DAZL同系物对生殖细胞的分化都是非常重要的。DAZL基因的突变、微缺失以及表达下调均可引起生精障碍，导致雄性不育[3]。Ruggiu等发现，与正常鼠相比，杂合DAZL基因缺陷鼠的畸形精子率增高，但仍有正常生育力，而纯合鼠表现为严重的生殖细胞减少，成熟阻滞，睾丸体积减小，不能生育[4]。此外，Schrans-Stassen等研究证实，DAZL基因敲除鼠表现出双睾丸干细胞数目减少、以及减数分裂早期精原细胞分化失败，从而导致不育[5]。因此，研究DAZL基因及其编码蛋白对探索配子发生和成体生殖缺陷及修复具有重要意义。本试验主要对DAZL基因进行克隆和开展生物信息学分析，并构建牛DAZL基因真核表达载体pEGFP-N3-DAZL，以期为探索DAZL基因的功能和在精子发生过程中的作用提供前期基础和试验依据。
1材料与方法
1.1试验材料
成年牛（约40月龄）睾丸组织，取自哈尔滨成高子屠宰场；Trizol Reagent和lipofectamine2000购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自ABI公司，pEASY-T1 Simple Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司 DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及其他常规试剂均购自大连宝生物公司。
1.2试验方法
1.2.1牛DAZL基因的生物信息学分析利用DNAStra软件分析DAZL的一级结构；采用Clustal X进行DAZL基因同源性多重比对；采用MEGA4程序构建分子进化树。
1.2.2牛DAZL基因真核表达载体的构建参照GenBank牛DAZL基因序列（NM_001081725）设计其编码区特异性克隆引物F：CGGAATTCTATGTCTGCTGCAAATCCTGAGACTC和R：CGGATCCAACAGACTTAAGCACTGCCCGACTT（上、下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点），引物由华大基因公司合成。利用Trizol法提取成牛睾丸组织总RNA，并反转录成cDNA，以其为模板，利用高保真Prime-STAR HS DNA聚合酶对牛DAZL基因全长编码区进行RT-PCR扩增，目的片段经凝胶回收加A后连接到pEASY-T1 simple载体上，进一步亚克隆到pEGFP-N3载体上。构建好的质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后，送往北京华大公司测序。
2结果
2.1DAZL基因的生物信息学分析
2.1.1DAZL基因一级结构分析牛DAZL基因的CDS全长为888 bp，由264个腺嘌呤（A）、194个胞嘧啶（C）、187个鸟嘌呤（G）和243个胸腺嘧啶（T）组成，4种碱基的含量依次为29.73%、21.85%、21.06%、27.36%。该基因ORF位于 1 888 bp，编码295个氨基酸，含29个强碱性氨基酸残基（K，R），24个强酸性氨基酸（D，E），82个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V），103个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y），分子量为33.02 Ku，等电点为8.78，脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸所占比例较高。
2.1.2DAZL基因同源性分析从NCBI的GenBank数据库中选取人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、中国牦牛（domestic yak）、猪（Sus scrofa）、狨猴（Callithrix jacchus）、松鼠猴（Saimiri sciureus）、小黑猩猩（Pan paniscus）、獠狨（Saguinus oedipus）、原鸡（Gallus gallus）共11个物种的DAZL基因，采用Clustal X进行多重比对，结果显示牛与中国牦牛的同源性最高，为99%，与小鼠、人、狨猴、小黑猩猩、猪、獠狨、松鼠猴、大鼠、原鸡的同源性分别为98%、97%、97%、97%、97%、96%、96%、92%、80%（图1）。 2.1.3分子进化树构建使用MEGA4程序，采用 Neighbor-Joining 算法，Bootstrap设为1 000，构建分子进化树，从树的拓扑结构上来看，牛的DAZL基因与中国牦牛的关系最近，与大鼠和小鼠一同构成了一个小群，同人、獠狨、猪共同构成一个亚类群（图2）。
2.2DAZL基因编码区的克隆
提取的RNA进行反转录合成cDNA，检测内参基因和DAZL基因的表达情况，结果发现成年牛睾丸中有DAZL基因的表达。
以成年牛睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出1条与预期长度相符的片段，得到了DAZL基因的全部编码区（图3-A）。将扩增出与预期长度相符的片段进行胶回收，与PMD18-T载体连接、转化，对构建的载体进行PCR鉴定和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示在902 bp处出现特异条带（图3-B、图3-C），与预期的插入片段大小相符。
2.3表达载体的制备与鉴定
将DAZL-PMD18-T和PEGFP-N3进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、胶回收，然后按摩尔比1 ∶1的量，用T4 DNA连接酶进行连接，得到构建的载体，然后将构建好的DAZL表达载体进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及PCR鉴定，琼脂糖凝胶检测为所要片段大小（图4）。转化，挑菌阳性克隆进行序列测定，测序正确的质粒用于下一步的试验。
3讨论
不同物种DAZL基因具有高度的同源相似性，参与调控生殖细胞的发育和分化。有研究表明，DAZL基因的缺失或突变会引起精子发生过程中减数分裂阻滞，导致精子缺乏和男性不育[3]。小鼠DAZL基因突变可影响两性生殖细胞的功能，DAZL基因敲除鼠表现出不育[5]。DAZL和BOULE都是DAZ家族的重要成员，二者都具有典型的RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRM）和DAZ重复序列[6]，能够与一系列影响精子发生基因的mRNA结合，如CDC25A、TPX1、DDX4和TSSK3等[7]，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用。
将目的基因超表达是研究基因功能的主要手段之一[8-9]，即将目标基因与合适的载体相连接，使其在体外或体内过量表达，观察该基因超量表达后细胞或组织或机体所发生的表型变化，从而对该基因的功能作出评价。Yu等利用DAZL基因的超表达技术，将胚胎干细胞诱导分化成精子样细胞[10-11]，可见DAZL基因是精子发生的一个主要基因。本试验扩增牛DAZL基因的编码区，构建了PEGFP-N3-DAZL表达载体，为进一步探讨DAZL基因超表达的体细胞能否向精细胞方向分化、DAZL基因超表达的生殖干细胞能否加速分化形成精子奠定基础。
4结论
本试验成功构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-DAZL，为阐明DAZL基因调控精子发生的机制奠定基础。
参考文献：
[1]Moore F L，Jaruzelska J，Dorfman D M，et al. Identification of a novel gene，DZIP （DAZ-interacting protein），that encodes a protein that interacts with DAZ （deleted in azoospermia） and is expressed in embryonic stem cells and germ cells[J]. Genomics，2004，83（5）： 834-843.
[2]Saxena R，Brown L G，Hawkins T，et al. The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed，repeatedly amplified and pruned[J]. Nature Genetics，1996，14（3）：292-299.
[3]Reynolds N，Cooke H J. Role of the DAZ genes in male fertility[J]. Reproductive BioMedicine Online，2005，10（1）：72-80.
[4]Ruggiu M，Saunders P T，Cooke H J. Dynamic subcellular distribution of the DAZL protein is confined to primate male germ cells[J]. Journal of Andrology，2000，21（3）：470-477.
[5]Schrans-Stassen B H，Saunders P T，Cooke H J，et al. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl—/- mice[J]. Biology of Reproduction，2001，65（3）：771-776.
[6]Eberhart C G，Maines J Z，Wasserman S A. Meiotic cell cycle requirement for a fly homologue of human deleted in azoospermia[J]. Nature，1996，381（6585）：783-785.
[7]Liu Z，Li Q，Pan Z，et al. Comparative analysis on mRNA expression level and methylation status of DAZL gene between cattle-yaks and their parents[J]. Animal Reproduction Science，2011，126（3/4）：258-264.
[8]束婧婷，宋卫涛，朱文奇，等. PGC-la基因在两种类型鸡骨骼肌间的表达差异[J]. 江苏农业学报，2013，29（1）：121-125.
[9]蒋香菊，吴阳升，林嘉鹏，等. 绵羊AMH基因的克隆、序列分析与原核表达[J]. 江苏农业学报，2013，29（6）：1386-1392.
[10]Yu Z，Ji P，Cao J，et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. Journal of Molecular Cell Biology，2009，1（2）：93-103.
[11]Kee K，Angeles V T，Flores M，et al. Human DAZL，DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation[J]. Nature，2009，462（7270）：222-225.
关键词：DAZL基因；序列；克隆；表达载体
中图分类号： S823.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0034-03
收稿日期：2014-03-21
基金项目：黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室开放课题（编号：GXZDSYS-2012-07）；东北农业大学博士启动基金（编号：2012RCB27）。
作者简介：郑鹏（1979—），男，黑龙江兰西人，博士，讲师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail：zh-96128@163.com。
通信作者：张贵学，博士，教授，博士生导师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail： gxzhang@neau.edu.cn。Deleted in azoospermia like （DAZL）基因是DAZ基因家族中的一员，最早克隆于蝇类的睾丸组织，是一个在进化上高度保守的基因，在脊椎动物的生殖细胞中特异表达，是生殖细胞形成所必须的调控因子。DAZL通过RNA识别基序与mRNA结合，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用[1]。DAZL基因是BOULE基因通过基因修饰、倍增而来，广泛分布于人类、鼠、爪蟾、蝾螈、斑马鱼、青鱼等物种中[2]。许多物种的DAZL同系物对生殖细胞的分化都是非常重要的。DAZL基因的突变、微缺失以及表达下调均可引起生精障碍，导致雄性不育[3]。Ruggiu等发现，与正常鼠相比，杂合DAZL基因缺陷鼠的畸形精子率增高，但仍有正常生育力，而纯合鼠表现为严重的生殖细胞减少，成熟阻滞，睾丸体积减小，不能生育[4]。此外，Schrans-Stassen等研究证实，DAZL基因敲除鼠表现出双睾丸干细胞数目减少、以及减数分裂早期精原细胞分化失败，从而导致不育[5]。因此，研究DAZL基因及其编码蛋白对探索配子发生和成体生殖缺陷及修复具有重要意义。本试验主要对DAZL基因进行克隆和开展生物信息学分析，并构建牛DAZL基因真核表达载体pEGFP-N3-DAZL，以期为探索DAZL基因的功能和在精子发生过程中的作用提供前期基础和试验依据。
1材料与方法
1.1试验材料
成年牛（约40月龄）睾丸组织，取自哈尔滨成高子屠宰场；Trizol Reagent和lipofectamine2000购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自ABI公司，pEASY-T1 Simple Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司 DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及其他常规试剂均购自大连宝生物公司。
1.2试验方法
1.2.1牛DAZL基因的生物信息学分析利用DNAStra软件分析DAZL的一级结构；采用Clustal X进行DAZL基因同源性多重比对；采用MEGA4程序构建分子进化树。
1.2.2牛DAZL基因真核表达载体的构建参照GenBank牛DAZL基因序列（NM_001081725）设计其编码区特异性克隆引物F：CGGAATTCTATGTCTGCTGCAAATCCTGAGACTC和R：CGGATCCAACAGACTTAAGCACTGCCCGACTT（上、下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点），引物由华大基因公司合成。利用Trizol法提取成牛睾丸组织总RNA，并反转录成cDNA，以其为模板，利用高保真Prime-STAR HS DNA聚合酶对牛DAZL基因全长编码区进行RT-PCR扩增，目的片段经凝胶回收加A后连接到pEASY-T1 simple载体上，进一步亚克隆到pEGFP-N3载体上。构建好的质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后，送往北京华大公司测序。
2结果
2.1DAZL基因的生物信息学分析
2.1.1DAZL基因一级结构分析牛DAZL基因的CDS全长为888 bp，由264个腺嘌呤（A）、194个胞嘧啶（C）、187个鸟嘌呤（G）和243个胸腺嘧啶（T）组成，4种碱基的含量依次为29.73%、21.85%、21.06%、27.36%。该基因ORF位于 1 888 bp，编码295个氨基酸，含29个强碱性氨基酸残基（K，R），24个强酸性氨基酸（D，E），82个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V），103个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y），分子量为33.02 Ku，等电点为8.78，脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸所占比例较高。
2.1.2DAZL基因同源性分析从NCBI的GenBank数据库中选取人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、中国牦牛（domestic yak）、猪（Sus scrofa）、狨猴（Callithrix jacchus）、松鼠猴（Saimiri sciureus）、小黑猩猩（Pan paniscus）、獠狨（Saguinus oedipus）、原鸡（Gallus gallus）共11个物种的DAZL基因，采用Clustal X进行多重比对，结果显示牛与中国牦牛的同源性最高，为99%，与小鼠、人、狨猴、小黑猩猩、猪、獠狨、松鼠猴、大鼠、原鸡的同源性分别为98%、97%、97%、97%、97%、96%、96%、92%、80%（图1）。 2.1.3分子进化树构建使用MEGA4程序，采用 Neighbor-Joining 算法，Bootstrap设为1 000，构建分子进化树，从树的拓扑结构上来看，牛的DAZL基因与中国牦牛的关系最近，与大鼠和小鼠一同构成了一个小群，同人、獠狨、猪共同构成一个亚类群（图2）。
2.2DAZL基因编码区的克隆
提取的RNA进行反转录合成cDNA，检测内参基因和DAZL基因的表达情况，结果发现成年牛睾丸中有DAZL基因的表达。
以成年牛睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出1条与预期长度相符的片段，得到了DAZL基因的全部编码区（图3-A）。将扩增出与预期长度相符的片段进行胶回收，与PMD18-T载体连接、转化，对构建的载体进行PCR鉴定和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示在902 bp处出现特异条带（图3-B、图3-C），与预期的插入片段大小相符。
2.3表达载体的制备与鉴定
将DAZL-PMD18-T和PEGFP-N3进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、胶回收，然后按摩尔比1 ∶1的量，用T4 DNA连接酶进行连接，得到构建的载体，然后将构建好的DAZL表达载体进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及PCR鉴定，琼脂糖凝胶检测为所要片段大小（图4）。转化，挑菌阳性克隆进行序列测定，测序正确的质粒用于下一步的试验。
3讨论
不同物种DAZL基因具有高度的同源相似性，参与调控生殖细胞的发育和分化。有研究表明，DAZL基因的缺失或突变会引起精子发生过程中减数分裂阻滞，导致精子缺乏和男性不育[3]。小鼠DAZL基因突变可影响两性生殖细胞的功能，DAZL基因敲除鼠表现出不育[5]。DAZL和BOULE都是DAZ家族的重要成员，二者都具有典型的RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRM）和DAZ重复序列[6]，能够与一系列影响精子发生基因的mRNA结合，如CDC25A、TPX1、DDX4和TSSK3等[7]，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用。
将目的基因超表达是研究基因功能的主要手段之一[8-9]，即将目标基因与合适的载体相连接，使其在体外或体内过量表达，观察该基因超量表达后细胞或组织或机体所发生的表型变化，从而对该基因的功能作出评价。Yu等利用DAZL基因的超表达技术，将胚胎干细胞诱导分化成精子样细胞[10-11]，可见DAZL基因是精子发生的一个主要基因。本试验扩增牛DAZL基因的编码区，构建了PEGFP-N3-DAZL表达载体，为进一步探讨DAZL基因超表达的体细胞能否向精细胞方向分化、DAZL基因超表达的生殖干细胞能否加速分化形成精子奠定基础。
4结论
本试验成功构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-DAZL，为阐明DAZL基因调控精子发生的机制奠定基础。
参考文献：
[1]Moore F L，Jaruzelska J，Dorfman D M，et al. Identification of a novel gene，DZIP （DAZ-interacting protein），that encodes a protein that interacts with DAZ （deleted in azoospermia） and is expressed in embryonic stem cells and germ cells[J]. Genomics，2004，83（5）： 834-843.
[2]Saxena R，Brown L G，Hawkins T，et al. The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed，repeatedly amplified and pruned[J]. Nature Genetics，1996，14（3）：292-299.
[3]Reynolds N，Cooke H J. Role of the DAZ genes in male fertility[J]. Reproductive BioMedicine Online，2005，10（1）：72-80.
[4]Ruggiu M，Saunders P T，Cooke H J. Dynamic subcellular distribution of the DAZL protein is confined to primate male germ cells[J]. Journal of Andrology，2000，21（3）：470-477.
[5]Schrans-Stassen B H，Saunders P T，Cooke H J，et al. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl—/- mice[J]. Biology of Reproduction，2001，65（3）：771-776.
[6]Eberhart C G，Maines J Z，Wasserman S A. Meiotic cell cycle requirement for a fly homologue of human deleted in azoospermia[J]. Nature，1996，381（6585）：783-785.
[7]Liu Z，Li Q，Pan Z，et al. Comparative analysis on mRNA expression level and methylation status of DAZL gene between cattle-yaks and their parents[J]. Animal Reproduction Science，2011，126（3/4）：258-264.
[8]束婧婷，宋卫涛，朱文奇，等. PGC-la基因在两种类型鸡骨骼肌间的表达差异[J]. 江苏农业学报，2013，29（1）：121-125.
[9]蒋香菊，吴阳升，林嘉鹏，等. 绵羊AMH基因的克隆、序列分析与原核表达[J]. 江苏农业学报，2013，29（6）：1386-1392.
[10]Yu Z，Ji P，Cao J，et al. Dazl promotes germ cell differentiation from embryonic stem cells[J]. Journal of Molecular Cell Biology，2009，1（2）：93-103.
[11]Kee K，Angeles V T，Flores M，et al. Human DAZL，DAZ and BOULE genes modulate primordial germ-cell and haploid gamete formation[J]. Nature，2009，462（7270）：222-225.