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摘要 为筛选出高产纤维素酶菌株，采用刚果红培养基对从自然界中取回的样品进行显色试验，筛选出酶活较高的菌株1号菌和2号菌，并对这2种菌株进行固体发酵试验。结果表明：1号菌和2号菌纤维素酶活第3天显著高于对照组（P<0.05），最高酶活分别为278.35、274.39 IU/g，1号和2号菌对秸秆中纤维素和半纤维素的最高降解率分别为16.18%、52.45%和14.89%、45.31%，对秸秆中的木质素没有降解作用。
关键词 纤维素酶；筛选；固体发酵；酶活；秸秆
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）20-0203-02
Screening of Fungi Producing Cellulase and Its Degradation on Straw
ZHANG Yan-ting 1 MA Yi 2
（1Animal Disease Prevention and Control Center in Xihua County of Henan Province，Xihua Henan 466600； 2 Zhengzhou Maike Feed Co.，Ltd.）
Abstract The strains which could produce high activity cellulase had been chosed，so the straws could be degraded into things that were good for the environment.Then the strains could be used in our lives.Method：Because of the proportion to the diameter of transparent ring and the diameter of the strain，we chose the strains NO.1 and NO.2.Solid fermentation method was used to culture the two strains，then we detected the enzyme activity.It was true that the enzyme activities of the two strains were all very high.Results：The two strains were cultured for 3 days，in this condition，the highest enzyme activity of the strains were 278.35 IU/g and 274.39 IU/g，respectively（P<0.05）.The highest degradation rate of No.1 and No.2 on cellulose and hemicellulose were 16.18%，52.45% and 14.89%，45.31%，respectively.There wasn′t degradation of No.1 and No.2 on lignin。
Key words cellulase；screening；solid fermentation；enzyme activity； straw
纤维素是自然界分布较广、来源丰富的一种可再生资源。我国纤维素类资源非常丰富，作为农业大国每年产的农作物秸秆有5.7亿t[1]。农作物秸秆中粗纤维含量高达40%左右，但由于粗纤维中的纤维素、半纤维素和木质素紧密结合，很难被有效利用，大多数农作物秸秆都被焚烧处理，既浪费了资源，又造成一系列环境问题[2]。
纤维素酶在分解纤维素时起主要的生物催化作用，纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌和真菌都能产生纤维素酶，真菌产生的纤维素酶属于胞外酶，大多数用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）[3]。从自然界当中筛选高活力适应性强的纤维素酶产生菌，对于纤维素资源的合理利用具有十分重要的意义。该试验通过从腐烂的木头中筛选出适应性较强的纤维素酶产生菌，并对筛选菌进行固体发酵培养，研究其产酶特性及对秸秆中纤维成分的影响，以为纤维素资源的有效利用以及环境改善提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品。从落叶聚集处收集到的腐烂的木头及树枝。
1.1.2 主要仪器。电子天平、精密pH计、恒温培养箱、 高速台式离心机、可见光分光光度计、恒温水浴锅、漩涡振荡器、超净工作台等。
1.1.3 培养基。①刚果红纤维素琼脂培养基：KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、琼脂粉14 g、明胶2.0 g、纤维素粉1.88 g、刚果红0.20 g、蒸馏水1 000 mL。②PDA液体培养基：可溶性淀粉0.6%、大豆蛋白0.5%、葡萄糖2%、琼脂2%、酵母粉0.2%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.03%。③固体发酵培养基：玉米秸秆∶麸皮为9∶1，以固液比1∶1.5的比例加入复合营养液。④复合营养液：氨基乙酸、0.59 g/L MgSO4·7H2O、2.96 g/L MnSO4·H2O、0.49 g/L NaCl、1.00 g/L FeSO4·7H2O、0.1 mg/L CaCl2、0.1 mg/L CoCl2、0.1 g/L ZnSO4·7H2O、0.1 g/L CuSO4·5H2O、0.01 mg/L KAl（SO4）2·7H2O、0.01 g/L HBO3。 1.2 试验方法
1.2.1 纤维素产生菌的初步筛选[4-5]。准确称取1 g腐烂样品置于烧杯中，加入20 mL经高压灭菌的生理盐水浸泡30 min以上，然后取200 μL均匀涂布秸秆选择性培养基上，30 ℃培养3 d后，挑去单菌落接种在刚果红培养基上。30 ℃培养3 d，进一步观察菌株生长特征及所产生的透明圈大小。选取透明圈与菌株直径比值较大的2个菌株，进行下一步培养研究。
1.2.2 纤维素产生菌的固体发酵培养。将分离纯化后的菌株接种到PDA培养基中，30 ℃条件下静止培养3 d，然后用无菌生理盐水冲洗平板，轻轻地将琼脂平面的孢子刮下，并转移到已经灭菌的三角瓶中，采用平板计数法计算种曲孢子浓度（浓度为1×109个/mL左右）。取10 g固体发酵培养基装于250 mL三角瓶，每个菌株3个重复，高压灭菌后每个三角瓶接种2.5 mL孢子悬液，混匀后置于恒温培养箱中30 ℃培养。每隔2 d取烧瓶中少许样品，于阴凉干燥处晾干备用。
1.2.3 固体培养基中纤维素含量的测定[6-7]。纤维素含量的测定采用范氏洗涤纤维分析法，结果采用如下公式计算：
NDF含量（%）=NDF重（g）/M×100
ADF含量（%）=ADF重（g）/N×100
半纤维素含量（%）=NDF（%）-ADF（%）
纤维素含量（%）=ADF（%）-72%硫酸处理后的残渣（%）
木质素含量（%）=72%硫酸处理后的残渣（%）-灼烧后重（%）
式中，NDF为中性洗涤纤维，ADF为酸性洗涤纤维，M、N分别为测中性以及酸性洗涤纤维所称取的样品重。
1.2.4 固体培养基的纤维素酶活测定[8-9]。分别称取不同时期的样品1 g置于小烧杯中，每个烧杯中加入19 mL的生理盐水，浸泡2 h后，4 000 r/min离心5 min。取上清液作为酶液，用DNS法测定CMC酶活，以每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选
从所有样品和供试菌株中筛选到分解纤维素的菌株12株。将纯化菌株反复点种在纤维素—刚果红培养基平板上，得到2株透明圈直径较大的菌株。该2株菌在PDA平板上3 d即可长满平板，初期为白色，随后变为墨绿色和深绿色，初步鉴定为瑞氏木霉，命名为1号菌和2号菌。
2.2 固体发酵酶活变化情况
由表1可知，1号菌固体发酵培养在第3、5、7天CMC酶活差异不大（p>0.05），第9天酶活显著降低（p<0.05）。其中第7天酶活最高，达到278.35 IU/g。
由表2可知，2号菌固体发酵培养在第3、5、7天CMC酶活差异不大（p>0.05），第9天酶活显著降低（p<0.05）。其中第3天酶活最高，达到274.39 IU/g。
2.3 固体发酵对秸秆成分的影响
由表3可知，1号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（P<0.05），第5、7天纤维素和半纤维素的含量差异不大，但均低于第3天和对照组（P<0.05）。固体发酵培养对秸秆中木质素的含量没有显著的影响（P>0.05）。
由表4可知，2号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（p<0.05），第7天纤维素含量显著低于其余各组，半纤维素含量在发酵培养后的第3天显著降低，第5、7天差异不大，2号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（p<0.05）。木质素的含量在培养的过程中没有发生显著的变化（p>0.05）。
3 讨论
3.1 固体发酵酶活变化情况
杜仕凤等利用限制性内切酶介导的DNA整合技术获得了200多株木霉突变株，并从中筛选出I株产酶活性较高的康氏木霉REMI突变株进行优化培养487.38 IU/g。该试验中，1号菌和2号菌纤维素酶活第3天即相对较高，最高酶活分别为278.35、274.39 IU/g。王慧杰等对降解纤维素酶的菌株进行筛选，选出菌株酶活最高为164 IU/g。该试验酶活稍低于杜仕凤的报道结果，可能与菌种及培养基未经优化培养等因素有关。
该试验中1号菌和2号菌的酶活第3天即达到最高，和第5、7天差异不显著（p>0.05），第9天酶活显著下降，这与卢月霞等的报道一致。这可能与该2种菌株第3天菌体大量增加有关，此时其分泌的纤维素酶量逐渐增加，纤维素酶活也达到最高。随着时间的增加，7 d后菌体逐渐衰退，其分泌的酶量逐渐下降。
3.2 固体发酵对秸秆成分的影响
该试验中1号菌和2号菌第3天即显著降低了秸秆中的纤维素和半纤维素的含量（p<0.05），这可能与这2株真菌第3天纤维素酶活达到最高有关。在培养过程中1号和2号菌纤维素和半纤维素的最高降解率分别为16.18%、52.45%和14.89%、45.31%。曾青兰等筛选出一株纤维素酶高产菌，经固体发酵8 d后，纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率分别为38.9%、57.9%、26.5%。牛俊玲等[10]也曾报道用木质纤维素复合菌发酵秸秆纤维素和半纤维素含量分别降低7.39%、43.76%左右。
该试验所筛选菌株对秸秆中半纤维素的降解率比较高，对秸秆中纤维素的降解率相对较低，对木质素没有明显的作用。这是因为纤维素是植物的结构多糖，是细胞壁的主要组成部分，不溶于水及其他多种有机溶剂。半纤维素是碱溶性的植物细胞壁多糖，具有亲水性能，相对容易受到酶的攻击[11]。木质素是植物的主要成分之一，包裹在纤维素的外面，功能之一就是保护植物细胞不受外界微生物的侵蚀。木质素是结构复杂、稳定、多样的无定形三维体型大分子，在自然界中降解较缓慢，成为地球生物圈中碳循环的障碍[12-13]。因此，对秸秆进行合理的物理化学预处理，降解其中的木质素，也是提高秸秆生物转化效率需要进一步研究的内容。
4 参考文献
[1] 郝月，杨翔华，张晶，等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报，2005（7）：58-60.
[2] 陈复，郝吉明，唐华俊，等.中国人口、资源、环境与可持续发展战略研究[M].北京：环境科学出版社，2000：340-343.
[3] 丁国伟.纤维素酶及其应用介绍[J].大众科学，2007（11）：6.
[4] 齐云，袁月详，陈飞，等.一组纤维素分解菌的分离、筛选及产酶条件的研究[J].天然产物研究与开发，2003，15（6）：235-237.
[5] 高榕，邓迎达.高生产效率纤维素酶菌株初筛选方法的研究[J].纤维素科学与技术，2004，12（3）：20-24.
[6] 薛惠琴，杭怡琼，陈谊，等.稻草秸秆中木质素、纤维素测定方法的研讨[J].上海畜牧兽医通讯，2001，4（2）：5-10.
[7] 杜甫佑，张晓昱，王宏勋.木质纤维素的定量测定及降解规律的初步研究[J].生物技术，2004，14（5）：3-8.
[8] 中国科学院上海植物生理研究所.二株高活力纤维素分解菌N2-78和EA3-867的获得及其特性的比较[J].微生物学报，1978，18（1）：27-38.
[9] 王淑军.纤维素酶酶解稻壳条件实验[J].微生物学报，1995（6）：354-357.
[10] 牛俊玲，崔宗均，李国学，等.高效纤维素分解菌复合系的筛选构建及其对秸秆的分解特性[J].农业环境科学学报，2005（4）：1.
[11] 王镜岩，朱圣庚，徐长法，等.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2005.
[12] 谢君，任路，李维，等.白腐菌液体培养产生木质纤维素降解酶的研究[J].四川大学学报：自然科学版，2000，37（S1）：161-166.
[13] 张辉，桑青，马艳霞，等.嗜热侧孢霉固体发酵产纤维素酶条件研究[J].食品研究与开发，2008（1）：1-2.
关键词 纤维素酶；筛选；固体发酵；酶活；秸秆
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）20-0203-02
Screening of Fungi Producing Cellulase and Its Degradation on Straw
ZHANG Yan-ting 1 MA Yi 2
（1Animal Disease Prevention and Control Center in Xihua County of Henan Province，Xihua Henan 466600； 2 Zhengzhou Maike Feed Co.，Ltd.）
Abstract The strains which could produce high activity cellulase had been chosed，so the straws could be degraded into things that were good for the environment.Then the strains could be used in our lives.Method：Because of the proportion to the diameter of transparent ring and the diameter of the strain，we chose the strains NO.1 and NO.2.Solid fermentation method was used to culture the two strains，then we detected the enzyme activity.It was true that the enzyme activities of the two strains were all very high.Results：The two strains were cultured for 3 days，in this condition，the highest enzyme activity of the strains were 278.35 IU/g and 274.39 IU/g，respectively（P<0.05）.The highest degradation rate of No.1 and No.2 on cellulose and hemicellulose were 16.18%，52.45% and 14.89%，45.31%，respectively.There wasn′t degradation of No.1 and No.2 on lignin。
Key words cellulase；screening；solid fermentation；enzyme activity； straw
纤维素是自然界分布较广、来源丰富的一种可再生资源。我国纤维素类资源非常丰富，作为农业大国每年产的农作物秸秆有5.7亿t[1]。农作物秸秆中粗纤维含量高达40%左右，但由于粗纤维中的纤维素、半纤维素和木质素紧密结合，很难被有效利用，大多数农作物秸秆都被焚烧处理，既浪费了资源，又造成一系列环境问题[2]。
纤维素酶在分解纤维素时起主要的生物催化作用，纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。细菌和真菌都能产生纤维素酶，真菌产生的纤维素酶属于胞外酶，大多数用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属（Trichoderma）、曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）[3]。从自然界当中筛选高活力适应性强的纤维素酶产生菌，对于纤维素资源的合理利用具有十分重要的意义。该试验通过从腐烂的木头中筛选出适应性较强的纤维素酶产生菌，并对筛选菌进行固体发酵培养，研究其产酶特性及对秸秆中纤维成分的影响，以为纤维素资源的有效利用以及环境改善提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品。从落叶聚集处收集到的腐烂的木头及树枝。
1.1.2 主要仪器。电子天平、精密pH计、恒温培养箱、 高速台式离心机、可见光分光光度计、恒温水浴锅、漩涡振荡器、超净工作台等。
1.1.3 培养基。①刚果红纤维素琼脂培养基：KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、琼脂粉14 g、明胶2.0 g、纤维素粉1.88 g、刚果红0.20 g、蒸馏水1 000 mL。②PDA液体培养基：可溶性淀粉0.6%、大豆蛋白0.5%、葡萄糖2%、琼脂2%、酵母粉0.2%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.03%。③固体发酵培养基：玉米秸秆∶麸皮为9∶1，以固液比1∶1.5的比例加入复合营养液。④复合营养液：氨基乙酸、0.59 g/L MgSO4·7H2O、2.96 g/L MnSO4·H2O、0.49 g/L NaCl、1.00 g/L FeSO4·7H2O、0.1 mg/L CaCl2、0.1 mg/L CoCl2、0.1 g/L ZnSO4·7H2O、0.1 g/L CuSO4·5H2O、0.01 mg/L KAl（SO4）2·7H2O、0.01 g/L HBO3。 1.2 试验方法
1.2.1 纤维素产生菌的初步筛选[4-5]。准确称取1 g腐烂样品置于烧杯中，加入20 mL经高压灭菌的生理盐水浸泡30 min以上，然后取200 μL均匀涂布秸秆选择性培养基上，30 ℃培养3 d后，挑去单菌落接种在刚果红培养基上。30 ℃培养3 d，进一步观察菌株生长特征及所产生的透明圈大小。选取透明圈与菌株直径比值较大的2个菌株，进行下一步培养研究。
1.2.2 纤维素产生菌的固体发酵培养。将分离纯化后的菌株接种到PDA培养基中，30 ℃条件下静止培养3 d，然后用无菌生理盐水冲洗平板，轻轻地将琼脂平面的孢子刮下，并转移到已经灭菌的三角瓶中，采用平板计数法计算种曲孢子浓度（浓度为1×109个/mL左右）。取10 g固体发酵培养基装于250 mL三角瓶，每个菌株3个重复，高压灭菌后每个三角瓶接种2.5 mL孢子悬液，混匀后置于恒温培养箱中30 ℃培养。每隔2 d取烧瓶中少许样品，于阴凉干燥处晾干备用。
1.2.3 固体培养基中纤维素含量的测定[6-7]。纤维素含量的测定采用范氏洗涤纤维分析法，结果采用如下公式计算：
NDF含量（%）=NDF重（g）/M×100
ADF含量（%）=ADF重（g）/N×100
半纤维素含量（%）=NDF（%）-ADF（%）
纤维素含量（%）=ADF（%）-72%硫酸处理后的残渣（%）
木质素含量（%）=72%硫酸处理后的残渣（%）-灼烧后重（%）
式中，NDF为中性洗涤纤维，ADF为酸性洗涤纤维，M、N分别为测中性以及酸性洗涤纤维所称取的样品重。
1.2.4 固体培养基的纤维素酶活测定[8-9]。分别称取不同时期的样品1 g置于小烧杯中，每个烧杯中加入19 mL的生理盐水，浸泡2 h后，4 000 r/min离心5 min。取上清液作为酶液，用DNS法测定CMC酶活，以每小时由底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选
从所有样品和供试菌株中筛选到分解纤维素的菌株12株。将纯化菌株反复点种在纤维素—刚果红培养基平板上，得到2株透明圈直径较大的菌株。该2株菌在PDA平板上3 d即可长满平板，初期为白色，随后变为墨绿色和深绿色，初步鉴定为瑞氏木霉，命名为1号菌和2号菌。
2.2 固体发酵酶活变化情况
由表1可知，1号菌固体发酵培养在第3、5、7天CMC酶活差异不大（p>0.05），第9天酶活显著降低（p<0.05）。其中第7天酶活最高，达到278.35 IU/g。
由表2可知，2号菌固体发酵培养在第3、5、7天CMC酶活差异不大（p>0.05），第9天酶活显著降低（p<0.05）。其中第3天酶活最高，达到274.39 IU/g。
2.3 固体发酵对秸秆成分的影响
由表3可知，1号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（P<0.05），第5、7天纤维素和半纤维素的含量差异不大，但均低于第3天和对照组（P<0.05）。固体发酵培养对秸秆中木质素的含量没有显著的影响（P>0.05）。
由表4可知，2号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（p<0.05），第7天纤维素含量显著低于其余各组，半纤维素含量在发酵培养后的第3天显著降低，第5、7天差异不大，2号菌固体发酵培养的秸秆第3天纤维素和半纤维素的含量显著低于对照组（p<0.05）。木质素的含量在培养的过程中没有发生显著的变化（p>0.05）。
3 讨论
3.1 固体发酵酶活变化情况
杜仕凤等利用限制性内切酶介导的DNA整合技术获得了200多株木霉突变株，并从中筛选出I株产酶活性较高的康氏木霉REMI突变株进行优化培养487.38 IU/g。该试验中，1号菌和2号菌纤维素酶活第3天即相对较高，最高酶活分别为278.35、274.39 IU/g。王慧杰等对降解纤维素酶的菌株进行筛选，选出菌株酶活最高为164 IU/g。该试验酶活稍低于杜仕凤的报道结果，可能与菌种及培养基未经优化培养等因素有关。
该试验中1号菌和2号菌的酶活第3天即达到最高，和第5、7天差异不显著（p>0.05），第9天酶活显著下降，这与卢月霞等的报道一致。这可能与该2种菌株第3天菌体大量增加有关，此时其分泌的纤维素酶量逐渐增加，纤维素酶活也达到最高。随着时间的增加，7 d后菌体逐渐衰退，其分泌的酶量逐渐下降。
3.2 固体发酵对秸秆成分的影响
该试验中1号菌和2号菌第3天即显著降低了秸秆中的纤维素和半纤维素的含量（p<0.05），这可能与这2株真菌第3天纤维素酶活达到最高有关。在培养过程中1号和2号菌纤维素和半纤维素的最高降解率分别为16.18%、52.45%和14.89%、45.31%。曾青兰等筛选出一株纤维素酶高产菌，经固体发酵8 d后，纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率分别为38.9%、57.9%、26.5%。牛俊玲等[10]也曾报道用木质纤维素复合菌发酵秸秆纤维素和半纤维素含量分别降低7.39%、43.76%左右。
该试验所筛选菌株对秸秆中半纤维素的降解率比较高，对秸秆中纤维素的降解率相对较低，对木质素没有明显的作用。这是因为纤维素是植物的结构多糖，是细胞壁的主要组成部分，不溶于水及其他多种有机溶剂。半纤维素是碱溶性的植物细胞壁多糖，具有亲水性能，相对容易受到酶的攻击[11]。木质素是植物的主要成分之一，包裹在纤维素的外面，功能之一就是保护植物细胞不受外界微生物的侵蚀。木质素是结构复杂、稳定、多样的无定形三维体型大分子，在自然界中降解较缓慢，成为地球生物圈中碳循环的障碍[12-13]。因此，对秸秆进行合理的物理化学预处理，降解其中的木质素，也是提高秸秆生物转化效率需要进一步研究的内容。
4 参考文献
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[11] 王镜岩，朱圣庚，徐长法，等.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2005.
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[13] 张辉，桑青，马艳霞，等.嗜热侧孢霉固体发酵产纤维素酶条件研究[J].食品研究与开发，2008（1）：1-2.