目的探讨体外长期培养的长白猪BMSCs全基因组DNA甲基化状态,阐明甲基化在调节基因表达上与BMSCs发生转化的关系。方法抽取3月龄长白猪胫骨近端骨髓,采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对BMSCs进行分离、纯化、体外传代培养。细胞恶性转化通过细胞形态、核型分析、双层软琼脂克隆形成实验、血清依赖性实验以及裸鼠成瘤实验进行验证。使用定制的家猪甲基化芯片和Agilent全基因组表达谱芯片,通过生物信息学分析获得第2代和第25代BMSCs全基因组甲基化表达水平和m RNA表达谱,并进行m RNA-甲基化的关联分析,筛选DNA异常甲基化谱,同时对这些基因进行KEGG富集分析。结果长期培养的BMSCs逐渐表现出转化细胞的特性:由较大的纺锤形逐渐变为小的梭形,血清依赖程度显著降低,在双层软琼脂培养基中锚着独立生长并形成细胞集落,在裸鼠体内形成肿瘤组织。全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的257条基因和下调表达的315条基因,信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调,部分细胞外基质受体相互作用(ECM-receptor interaction)、黏着斑通路(focal adhesion)、肌动蛋白细胞骨架调节(regulation of actin cytoskeleton)、癌症通路(pathways in cancer)、P53等通路相关基因表达下调。DNA甲基化芯片分析得到受甲基化调控的962条差异基因和1 219条受去甲基化的基因,并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程。联合分析BMSCs转化过程受甲基化调控的基因,发现35个基因的甲基化改变与表达变化方向相反(相关系数r=–0.686,P=0.000),其中21个基因启动子区甲基化程度升高而基因表达下降,14个基因启动子区甲基化程度下降而基因表达升高;同时KEGG富集分析发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路,其中在14条甲基化下调而表达上调的基因中,很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用,其中CDKN3启动子区甲基化状态改变可能与细胞肿瘤化密切相关。结论研究结果表明甲基化参与猪BMSCs自发转化,这为BMSCs临床应用预警和防止转化提供了新线索。