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摘要：目的 觀察脐灸疗法治疗缓解期溃疡性结肠炎（UC）的临床疗效，及其对患者结肠黏膜内BTNL2-HLA信号通路调控情况，探讨其治疗UC可能的作用机制。方法 采用随机数字表法将70例患者分为常规组和脐灸组各35例。常规组予柳氮磺吡啶肠溶片1.5～2 g/d，口服;脐灸组在常规组基础上行脐灸疗法，每周2次。2组均连续治疗12周。观察2组临床疗效，采用生物信息学逆向挖掘与BTNL2相关的调控分子及互作网络以确定其潜在的调控通路，实时荧光定量PCR分析脐灸疗法对缓解期UC患者结肠黏膜内相关靶点的调控。结果 脐灸组完全缓解率为82.86%（29/35），常规组为51.43%（18/35），脐灸组明显优于常规组（P<0.05）。2组均可调控BTNL2-HLA信号通路关键靶点分子的表达，脐灸组对HLA-DQA1和HLA-DRA的调控效果更佳。2组对HLA-DMA、HLA-DQA2、HLA-DRB1无调控效果。结论 脐灸疗法对UC患者的治疗效果较好，BTNL2-HLA信号通路是其主要的作用通路之一。
关键词：生物信息学;脐灸疗法;溃疡性结肠炎;BTNL2-HLA;信号通路;作用机制
中图分类号：R259.746.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）08-0018-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.005 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To investigate the effects of umbilical moxibustion on the treatment of ulcerative colitis （UC） in remission stage; To analyze the regulation of BTNL2-HLA signaling pathway in the colonic mucosa of UC patients during the treatment; To speculate the mechanism of umbilical moxibustion in the treatment of UC. Methods Totally 70 patients were divided into control group and umbilical moxibustion group according to random number table method， with 35 cases in each group. The control group was given sulfasalazine enteric-coated tablets 1.5 to 2 g/d orally. In the umbilical moxibustion group， umbilical moxibustion was performed on the basis of the control group， twice a week. Both groups were treated continuously for 12 weeks. The clinical efficacy of the two groups was compared. The bioinformatics was used to reversely mine BTNL2-related regulatory molecules and interaction networks， and their potential regulatory pathways were further determined. RT-qPCR was used to analyze the regulation of umbilical moxibustion on the related targets in the colonic mucosa of the above UC patients. Results The complete remission rate was 82.86% （29/35） in the umbilical moxibustion group and 51.43% （18/35） in the control group. The umbilical moxibustion group was significantly better than the control group （P<0.05）. Bothgroups could regulate the expression of key target molecules in BTNL2-HLA signaling pathway， and the umbilical moxibustion group had better control effect on HLA-DQA1 and HLA-DRA. The two groups had no regulation effect on HLA-DMA， HLA-DQA2 and HLA-DRB1. Conclusion Umbilical moxibustion has a good therapeutic effect on UC patients. BTNL2-HLA signaling pathway is one of the main pathways.
Keywords： bioinformatics; umbilical moxibustion; ulcerative colitis; BTNL2-HLA; signaling pathways; mechanism 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属炎症性肠病（in?ammatory bowel disease，IBD）范畴。该病侵袭部位为直肠及结肠黏膜，临床表现为习惯性腹痛、腹泻及脓血便等[1]。目前，西医治疗UC主要采用免疫抑制剂、生物制剂、糖皮质激素及氨基酸水杨酸等。中医多以口服汤剂、灌肠、穴位贴敷及埋线等进行干预，取得了较好疗效[2]。UC发病与遗传因素、环境因素、微生物因素及免疫因素等有关[3]。研究显示，BTNL2与UC有着高度相关性[4]。BTNL2主要存在于黏膜细胞内，在IBD模型小鼠的B细胞中呈现较高表达[5]。本研究以BTNL2作为脐灸疗法治疗UC的分子切入点，通过生物信息学手段探究BTNL2-HLA信號通路在UC发病及脐灸疗法治疗过程中发挥的作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2017年3月-2018年3月东营市人民医院肛肠科、消化内科、康复科UC缓解期患者70例。采用随机数字表法分为常规组和脐灸组各35例。常规组男21例，女14例;平均年龄（42.7±8.9）岁;病程6～35个月，平均（15.0±3.7）个月。脐灸组男26例，女9例，平均年龄（47.2±6.8）岁;病程10～31个月，平均（12.0±5.3）个月。2组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经东营市人民医院医学伦理委员会审查批准（GC-2016-23）。
1.2 西医诊断标准
符合《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见（2017年）》[6]UC诊断标准;轻度或中度的活动期，经过系统治疗后进入UC缓解期[7]。
1.3 中医辨证标准
参照文献[8-9]制定脾肾阳虚内夹大肠湿热证辨证标准。脾肾阳虚：久病不愈，五更泻，便赤黏或稀薄，面色无华，患者多腰膝酸软，形寒肢冷，舌淡苔薄。内夹大肠湿热：腹部按压疼痛，便后缓解，肠鸣腹泻，舌红苔黄。
1.4 纳入标准
①符合上述西医诊断标准及中医辨证标准;②年龄16～65岁;③患者对本研究知情并签署知情同意书。
1.5 排除标准
①伴有心脑血管疾病，肝、肾功能不全及癌症等严重疾病;②患有严重的精神疾病，无法进行正常交流;③妊娠期或哺乳期妇女。
1.6 治疗方法
常规组予柳氮磺吡啶肠溶片（上海中西三维药业有限公司），1.5～2 g/d，口服。脐灸组在常规组基础上行脐灸疗法。脐灸粉含肉桂、补骨脂、肉豆蔻、延胡索、白芍、五味子、吴茱萸、川芎、当归、黄连、木香，取上药各等份，超微粉碎，过100目筛，研磨备用。用温开水将面粉制成小碗（碗底周长约15 cm，厚度约2 cm，周边略高起），底部中间孔与患者脐孔一致（直径2 cm）。患者仰卧位，暴露腹部，75%酒精棉球消毒后，将小碗置于神阙，用毛笔将3 g脐灸粉填满脐孔，将艾炷（直径2 cm，高2 cm）置于药粉上，点燃施灸，连续6壮，约1.5 h，脐灸结束后，撤下小碗，用干棉球清理脐周，无菌敷贴固定脐内脐灸粉，嘱患者24 h后自行取下，并用温水清理局部，避免受凉。每周2次。2组均连续治疗12周，治疗过程中禁食生冷瓜果。
1.7 疗效标准
1.7.1 临床疗效标准
参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[9]评价疗效。完全缓解：临床症状消失，结肠镜检提示肠黏膜恢复正常;有效：临床症状基本消失，结肠镜检提示黏膜轻度炎症反应和/或少量假息肉;无效：临床症状和结肠镜等检查均无变化。总有效率（%）=（完全缓解例数+有效例数）÷总例数×100%。完全缓解率（%）=完全缓解例数÷总例数×100%。
1.7.2 复发标准
①在症状缓解的基础上再次出现黏液脓血便、腹泻、腹痛、里急后重等表现，或在原减轻的基础上突然再次加重;②结肠镜检查再次出现浅表性溃疡，黏膜充血糜烂，病变呈连续性、弥漫性;或黏膜充血糜烂加重，并出现炎症息肉[10]。
1.8 生物信息学分析
采用string数据库对BTNL2对应的调控网络进行分析，获得上下游蛋白互作（PPI）网络数据。采用cytosacpe3.7.2的mcode插件，获得其调控的核心PPI及hub基因;再以cytoscape3.7.2软件的goClue插件，获得上述hub基因调控的KEGG网络并进行功能富集。筛选出上述KEGG通路内与UC相关的蛋白进行互作关系分析，最终筛选出调控核心的分子靶点作为后续临床研究对象。
1.9 BTNL2及信号通路验证
1.9.1 样品中RNA的提取
通过Ficoll-hypaque密度梯度离心法，获得结肠黏膜组织单个核细胞，提取RNA。具体操作严格按试剂盒说明进行。
1.9.2 基因扩增
本研究中9种引物分别应用Primer premier5.0软件设计后再行合成，同时应用人-18s作为内参引物，具体合成信息见表1。反应程序：95 ℃、3 min，95 ℃、10 s，58 ℃、30 s同时plate read;进行step2，共计39 cycles;溶解曲线分析（60～95 ℃，+1 ℃/cycle，4 s）。反应结束后对PCR最终结果进行分析。在Advanced relative compare analysis模式下，根据每次扩增的DNA量约增加2倍用来计算。基因相对表达量=2-ΔΔCt。
1.10 统计学方法
采用Graphpad prism7软件绘图并处理数据，SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析;计数资料采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果
2.1 2组临床疗效比较
脐灸组完全缓解率为82.86%（29/35），常规组为51.43%（18/35），脐灸组明显优于常规组（P<0.05）;脐灸组总有效率为97.14%（34/35），常规组为85.71%（30/35），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.2 脐灸疗法治疗溃疡性结肠炎生物信息学分析
根据生物信息学分析结果，可在string数据库内找到BTNL2调控的上下游biomarker，这些biomarker或由BTNL2在上游进行调控，或直接调控下游BTNL2表达。为进一步确定其与BTNL2的互作关系，采用cytoscape3.7.2软件对上述biomarker互作关系进行分析，找到其中关系较为密切的领域蛋白，见图1A。可以看出，与BTNL2关系较为密切的biomarker主要为HLA家族内的一系列分子。继续采用cytoscape3.7.2的mcode插件对已获得的PPI进行分析，最终获得的互作网络见图1B。可见，上述biomarker间的关系密切，并通过该PPI协同调控了BTNL2的表达。为了进一步考察其与UC的联系，采用cytoscape3.7.2的goClue插件对上述biomarker进行分析，最终建立其与UC发病间的联系。由此可知，HLA-DMA等8个蛋白与IBD及肠道免疫网络中IgA的产生有密切联系，见图1C。为进一步确定上述HLA家族蛋白及BTNL2等biomarker在UC发病过程中的联系，本研究应用PCR手段，针对已经获得样本中上述biomarker的表达情况进行分析，以确定其调控关系。
2.3 结肠黏膜组织目标分子的实时荧光定量PCR验证结果
为辨别2种治疗方案中治疗机制的区别，仅选取完全缓解病例样本进行分析。见图2。
由图2可知，脐灸疗法和常规疗法对患者组织内HLA-DMA、HLA-DPBI、HLA-DQA2、HLA-DRB1表达无明显影响。2组治疗后其他biomarker下降趋势较大。如脐灸组治疗后，BTNL2表达明显上调（P<0.001），HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB5表达明显下调（P<0.001）;常规组治疗后BTNL2上调（P<0.05），HLA-DQB1、HLA-DRA表达明显下调（P<0.001），HLA-DQA1、HLA-DRB5表达下调（P<0.05）。脐灸组BTNL2、HLA-DQA1、HLA-DRA表达与常规组比较差异有统计学意义（P<0.001，P<0.05）。
3 讨论
UC临床常见大肠湿热证、脾胃虚弱证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、寒热错杂证、血瘀肠络证、阴虚肠燥证等证型[11]。脐灸疗法补脾益气、补火助肾，通过鼓动脾肾阳气，加速水液代謝，可改善大肠内湿邪过重的情况，治疗UC效果显著。由于脾肾之虚无力鼓动人体内水液代谢，长期淤积于大肠而致病。且水液运化不足，湿裹大肠，便行受阻，进一步加剧病情。本研究显示，脐灸组临床疗效明显优于常规组，这与其他临床研究结果类似[12-13]。
UC为免疫性疾病，主要表现为结肠黏膜层的炎症反应和溃疡。免疫因素是UC的重要病因[14-15]。研究显示，UC发病及加重过程中抗炎因子如IL-10、IL-4表达明显下调[16-17]，促炎因子如IL-6、IL-8表达明显上调[18-19]。但仅从细胞因子水平变化的角度对UC发病机制进行分析稍显不足。随着现代生物技术的发展，生物信息学在疾病预测及机制分析过程中发挥重要作用，数据挖掘手段可综合以往报道对现有资料进行整合分析，快速获得疾病数据资源。本研究借助生物信息学方法，直接从string数据库内获得目标靶点的互作分子，获得其调控UC的潜在PPI。
BTNL2属嗜乳脂蛋白家族的成员，其主要通过抑制Th1的细胞增殖及相关的细胞的分泌而实现其免疫调节作用。BTNL2主要在B细胞表达，但其本身不会影响B细胞增殖;BTNL2亦可活化T细胞，抑制由anti-CD3抗体引起的CD4阳性细胞增殖活化，同时下调ICOS/BN7RP-1信号通路所介导的T细胞活化[20]。BTNL2虽可抑制T细胞活化及IL-2释放，但不会随着IL-2补充而完全解除。根据文献可推测，与其他B7家族（如B7S1或B7-H3[21]）不同，其对T细胞的活化抑制，并非全部通过IL-2[5]。BTNL2主要通过阻碍Akt蛋白介导Foxo1的失活效应，从而降低Foxp3的表达，最终影响T细胞的活化和功能[20]。
UC出现T细胞亚群活化异常，如CD3+、CD4+、CD8+等T细胞明显增加。而BTNL2对T细胞的活化抑制可能与UC治疗/发病有密切联系。根据BTNL2多态性研究可知，BTNL2与冠状动脉性疾病[22]、结节病[23]及关节炎[24]发病显著相关。在UC发病过程中，BTNL2多个位点均与UC发病密切相关。部分位点如rs2294881、rs9268480变异，与UC的发病及治愈高度相关[25]。
虽然不能从基因多态性的结果直接断定BTNL2分子在UC发病过程中的作用，但上述结果可为UC临床治疗提供一定参考。基于此，我们借助生物信息学手段对BTNL2的PPI特征进行了详细分析。根据string预测结果可知，BTNL2主要与HLA-D家族的互作关系最为密切。
针对HLA家族研究极为广泛。HLA是人类染色体中多态性程度最高的区域。而上述研究多集中于疾病易感性个体差异，有近70种疾病的发生与HLA基因变异存在关联[26]。然而，针对该家族特异性免疫应答的研究，特别是与UC发病相关性的研究较少。其中，HLA-D属于HLA-Ⅱ类分子，其生物学功能为递呈外源性的抗原，激活后续的免疫应答反应。根据之前的基因多态性研究也发现，HLA-D分子与UC发病关系密切[27-28]。由此推论，在UC发病过程中，HLA-D分子起到了抗原递呈作用。而HLA-D的过表达会进一步介导其免疫反应。 本研究显示，脐灸疗法可有效提升患者肠黏膜BTNL2表达;进一步根据HLA的表达结果可以确认，在UC治疗过程中，脐灸疗法与常规治疗法调控BTNL2-HLA的方式基本类似。由图2可知，除上调BTNL2分子的表达结果外，其对HLA-DQA1及HLA-DRA的表达效果更好。由此推论，脐灸疗法对上述2个HLA分子的抑制效果优于传统疗法，这可能是脐灸疗法优于常规疗法的重要原因。
本研究应用生物信息学方法对BTNL2针对UC治疗的潜在通路进行预测，并对脐灸疗法针对UC治疗过程中BTNL2-HLA所形成的PPI网络的表达情况进行分析，从分子机制层面验证了脐灸疗法疗效优于西药的原因。但本研究所采集的样本较少，且考虑到所选分子均为临床高变异分子，因此在分子机制验证过程中并未引入正常人群样本，可能限制了最终结果的准确性;且本研究仅考察脐灸疗法在治疗UC过程中相应分子的共表达变化趋势，对于其深层机制如二者是否存在调控关系、调控方式如何等未做研究。所得结论有待今后验证。
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（收稿日期：2018-11-13）
（修回日期：2019-03-06;编辑：季巍巍）
关键词：生物信息学;脐灸疗法;溃疡性结肠炎;BTNL2-HLA;信号通路;作用机制
中图分类号：R259.746.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）08-0018-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.08.005 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract： Objective To investigate the effects of umbilical moxibustion on the treatment of ulcerative colitis （UC） in remission stage; To analyze the regulation of BTNL2-HLA signaling pathway in the colonic mucosa of UC patients during the treatment; To speculate the mechanism of umbilical moxibustion in the treatment of UC. Methods Totally 70 patients were divided into control group and umbilical moxibustion group according to random number table method， with 35 cases in each group. The control group was given sulfasalazine enteric-coated tablets 1.5 to 2 g/d orally. In the umbilical moxibustion group， umbilical moxibustion was performed on the basis of the control group， twice a week. Both groups were treated continuously for 12 weeks. The clinical efficacy of the two groups was compared. The bioinformatics was used to reversely mine BTNL2-related regulatory molecules and interaction networks， and their potential regulatory pathways were further determined. RT-qPCR was used to analyze the regulation of umbilical moxibustion on the related targets in the colonic mucosa of the above UC patients. Results The complete remission rate was 82.86% （29/35） in the umbilical moxibustion group and 51.43% （18/35） in the control group. The umbilical moxibustion group was significantly better than the control group （P<0.05）. Bothgroups could regulate the expression of key target molecules in BTNL2-HLA signaling pathway， and the umbilical moxibustion group had better control effect on HLA-DQA1 and HLA-DRA. The two groups had no regulation effect on HLA-DMA， HLA-DQA2 and HLA-DRB1. Conclusion Umbilical moxibustion has a good therapeutic effect on UC patients. BTNL2-HLA signaling pathway is one of the main pathways.
Keywords： bioinformatics; umbilical moxibustion; ulcerative colitis; BTNL2-HLA; signaling pathways; mechanism 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）属炎症性肠病（in?ammatory bowel disease，IBD）范畴。该病侵袭部位为直肠及结肠黏膜，临床表现为习惯性腹痛、腹泻及脓血便等[1]。目前，西医治疗UC主要采用免疫抑制剂、生物制剂、糖皮质激素及氨基酸水杨酸等。中医多以口服汤剂、灌肠、穴位贴敷及埋线等进行干预，取得了较好疗效[2]。UC发病与遗传因素、环境因素、微生物因素及免疫因素等有关[3]。研究显示，BTNL2与UC有着高度相关性[4]。BTNL2主要存在于黏膜细胞内，在IBD模型小鼠的B细胞中呈现较高表达[5]。本研究以BTNL2作为脐灸疗法治疗UC的分子切入点，通过生物信息学手段探究BTNL2-HLA信號通路在UC发病及脐灸疗法治疗过程中发挥的作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2017年3月-2018年3月东营市人民医院肛肠科、消化内科、康复科UC缓解期患者70例。采用随机数字表法分为常规组和脐灸组各35例。常规组男21例，女14例;平均年龄（42.7±8.9）岁;病程6～35个月，平均（15.0±3.7）个月。脐灸组男26例，女9例，平均年龄（47.2±6.8）岁;病程10～31个月，平均（12.0±5.3）个月。2组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经东营市人民医院医学伦理委员会审查批准（GC-2016-23）。
1.2 西医诊断标准
符合《溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见（2017年）》[6]UC诊断标准;轻度或中度的活动期，经过系统治疗后进入UC缓解期[7]。
1.3 中医辨证标准
参照文献[8-9]制定脾肾阳虚内夹大肠湿热证辨证标准。脾肾阳虚：久病不愈，五更泻，便赤黏或稀薄，面色无华，患者多腰膝酸软，形寒肢冷，舌淡苔薄。内夹大肠湿热：腹部按压疼痛，便后缓解，肠鸣腹泻，舌红苔黄。
1.4 纳入标准
①符合上述西医诊断标准及中医辨证标准;②年龄16～65岁;③患者对本研究知情并签署知情同意书。
1.5 排除标准
①伴有心脑血管疾病，肝、肾功能不全及癌症等严重疾病;②患有严重的精神疾病，无法进行正常交流;③妊娠期或哺乳期妇女。
1.6 治疗方法
常规组予柳氮磺吡啶肠溶片（上海中西三维药业有限公司），1.5～2 g/d，口服。脐灸组在常规组基础上行脐灸疗法。脐灸粉含肉桂、补骨脂、肉豆蔻、延胡索、白芍、五味子、吴茱萸、川芎、当归、黄连、木香，取上药各等份，超微粉碎，过100目筛，研磨备用。用温开水将面粉制成小碗（碗底周长约15 cm，厚度约2 cm，周边略高起），底部中间孔与患者脐孔一致（直径2 cm）。患者仰卧位，暴露腹部，75%酒精棉球消毒后，将小碗置于神阙，用毛笔将3 g脐灸粉填满脐孔，将艾炷（直径2 cm，高2 cm）置于药粉上，点燃施灸，连续6壮，约1.5 h，脐灸结束后，撤下小碗，用干棉球清理脐周，无菌敷贴固定脐内脐灸粉，嘱患者24 h后自行取下，并用温水清理局部，避免受凉。每周2次。2组均连续治疗12周，治疗过程中禁食生冷瓜果。
1.7 疗效标准
1.7.1 临床疗效标准
参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[9]评价疗效。完全缓解：临床症状消失，结肠镜检提示肠黏膜恢复正常;有效：临床症状基本消失，结肠镜检提示黏膜轻度炎症反应和/或少量假息肉;无效：临床症状和结肠镜等检查均无变化。总有效率（%）=（完全缓解例数+有效例数）÷总例数×100%。完全缓解率（%）=完全缓解例数÷总例数×100%。
1.7.2 复发标准
①在症状缓解的基础上再次出现黏液脓血便、腹泻、腹痛、里急后重等表现，或在原减轻的基础上突然再次加重;②结肠镜检查再次出现浅表性溃疡，黏膜充血糜烂，病变呈连续性、弥漫性;或黏膜充血糜烂加重，并出现炎症息肉[10]。
1.8 生物信息学分析
采用string数据库对BTNL2对应的调控网络进行分析，获得上下游蛋白互作（PPI）网络数据。采用cytosacpe3.7.2的mcode插件，获得其调控的核心PPI及hub基因;再以cytoscape3.7.2软件的goClue插件，获得上述hub基因调控的KEGG网络并进行功能富集。筛选出上述KEGG通路内与UC相关的蛋白进行互作关系分析，最终筛选出调控核心的分子靶点作为后续临床研究对象。
1.9 BTNL2及信号通路验证
1.9.1 样品中RNA的提取
通过Ficoll-hypaque密度梯度离心法，获得结肠黏膜组织单个核细胞，提取RNA。具体操作严格按试剂盒说明进行。
1.9.2 基因扩增
本研究中9种引物分别应用Primer premier5.0软件设计后再行合成，同时应用人-18s作为内参引物，具体合成信息见表1。反应程序：95 ℃、3 min，95 ℃、10 s，58 ℃、30 s同时plate read;进行step2，共计39 cycles;溶解曲线分析（60～95 ℃，+1 ℃/cycle，4 s）。反应结束后对PCR最终结果进行分析。在Advanced relative compare analysis模式下，根据每次扩增的DNA量约增加2倍用来计算。基因相对表达量=2-ΔΔCt。
1.10 统计学方法
采用Graphpad prism7软件绘图并处理数据，SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，采用独立样本t检验，组间比较采用单因素方差分析;计数资料采用卡方检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果
2.1 2组临床疗效比较
脐灸组完全缓解率为82.86%（29/35），常规组为51.43%（18/35），脐灸组明显优于常规组（P<0.05）;脐灸组总有效率为97.14%（34/35），常规组为85.71%（30/35），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
2.2 脐灸疗法治疗溃疡性结肠炎生物信息学分析
根据生物信息学分析结果，可在string数据库内找到BTNL2调控的上下游biomarker，这些biomarker或由BTNL2在上游进行调控，或直接调控下游BTNL2表达。为进一步确定其与BTNL2的互作关系，采用cytoscape3.7.2软件对上述biomarker互作关系进行分析，找到其中关系较为密切的领域蛋白，见图1A。可以看出，与BTNL2关系较为密切的biomarker主要为HLA家族内的一系列分子。继续采用cytoscape3.7.2的mcode插件对已获得的PPI进行分析，最终获得的互作网络见图1B。可见，上述biomarker间的关系密切，并通过该PPI协同调控了BTNL2的表达。为了进一步考察其与UC的联系，采用cytoscape3.7.2的goClue插件对上述biomarker进行分析，最终建立其与UC发病间的联系。由此可知，HLA-DMA等8个蛋白与IBD及肠道免疫网络中IgA的产生有密切联系，见图1C。为进一步确定上述HLA家族蛋白及BTNL2等biomarker在UC发病过程中的联系，本研究应用PCR手段，针对已经获得样本中上述biomarker的表达情况进行分析，以确定其调控关系。
2.3 结肠黏膜组织目标分子的实时荧光定量PCR验证结果
为辨别2种治疗方案中治疗机制的区别，仅选取完全缓解病例样本进行分析。见图2。
由图2可知，脐灸疗法和常规疗法对患者组织内HLA-DMA、HLA-DPBI、HLA-DQA2、HLA-DRB1表达无明显影响。2组治疗后其他biomarker下降趋势较大。如脐灸组治疗后，BTNL2表达明显上调（P<0.001），HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DRB5表达明显下调（P<0.001）;常规组治疗后BTNL2上调（P<0.05），HLA-DQB1、HLA-DRA表达明显下调（P<0.001），HLA-DQA1、HLA-DRB5表达下调（P<0.05）。脐灸组BTNL2、HLA-DQA1、HLA-DRA表达与常规组比较差异有统计学意义（P<0.001，P<0.05）。
3 讨论
UC临床常见大肠湿热证、脾胃虚弱证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、寒热错杂证、血瘀肠络证、阴虚肠燥证等证型[11]。脐灸疗法补脾益气、补火助肾，通过鼓动脾肾阳气，加速水液代謝，可改善大肠内湿邪过重的情况，治疗UC效果显著。由于脾肾之虚无力鼓动人体内水液代谢，长期淤积于大肠而致病。且水液运化不足，湿裹大肠，便行受阻，进一步加剧病情。本研究显示，脐灸组临床疗效明显优于常规组，这与其他临床研究结果类似[12-13]。
UC为免疫性疾病，主要表现为结肠黏膜层的炎症反应和溃疡。免疫因素是UC的重要病因[14-15]。研究显示，UC发病及加重过程中抗炎因子如IL-10、IL-4表达明显下调[16-17]，促炎因子如IL-6、IL-8表达明显上调[18-19]。但仅从细胞因子水平变化的角度对UC发病机制进行分析稍显不足。随着现代生物技术的发展，生物信息学在疾病预测及机制分析过程中发挥重要作用，数据挖掘手段可综合以往报道对现有资料进行整合分析，快速获得疾病数据资源。本研究借助生物信息学方法，直接从string数据库内获得目标靶点的互作分子，获得其调控UC的潜在PPI。
BTNL2属嗜乳脂蛋白家族的成员，其主要通过抑制Th1的细胞增殖及相关的细胞的分泌而实现其免疫调节作用。BTNL2主要在B细胞表达，但其本身不会影响B细胞增殖;BTNL2亦可活化T细胞，抑制由anti-CD3抗体引起的CD4阳性细胞增殖活化，同时下调ICOS/BN7RP-1信号通路所介导的T细胞活化[20]。BTNL2虽可抑制T细胞活化及IL-2释放，但不会随着IL-2补充而完全解除。根据文献可推测，与其他B7家族（如B7S1或B7-H3[21]）不同，其对T细胞的活化抑制，并非全部通过IL-2[5]。BTNL2主要通过阻碍Akt蛋白介导Foxo1的失活效应，从而降低Foxp3的表达，最终影响T细胞的活化和功能[20]。
UC出现T细胞亚群活化异常，如CD3+、CD4+、CD8+等T细胞明显增加。而BTNL2对T细胞的活化抑制可能与UC治疗/发病有密切联系。根据BTNL2多态性研究可知，BTNL2与冠状动脉性疾病[22]、结节病[23]及关节炎[24]发病显著相关。在UC发病过程中，BTNL2多个位点均与UC发病密切相关。部分位点如rs2294881、rs9268480变异，与UC的发病及治愈高度相关[25]。
虽然不能从基因多态性的结果直接断定BTNL2分子在UC发病过程中的作用，但上述结果可为UC临床治疗提供一定参考。基于此，我们借助生物信息学手段对BTNL2的PPI特征进行了详细分析。根据string预测结果可知，BTNL2主要与HLA-D家族的互作关系最为密切。
针对HLA家族研究极为广泛。HLA是人类染色体中多态性程度最高的区域。而上述研究多集中于疾病易感性个体差异，有近70种疾病的发生与HLA基因变异存在关联[26]。然而，针对该家族特异性免疫应答的研究，特别是与UC发病相关性的研究较少。其中，HLA-D属于HLA-Ⅱ类分子，其生物学功能为递呈外源性的抗原，激活后续的免疫应答反应。根据之前的基因多态性研究也发现，HLA-D分子与UC发病关系密切[27-28]。由此推论，在UC发病过程中，HLA-D分子起到了抗原递呈作用。而HLA-D的过表达会进一步介导其免疫反应。 本研究显示，脐灸疗法可有效提升患者肠黏膜BTNL2表达;进一步根据HLA的表达结果可以确认，在UC治疗过程中，脐灸疗法与常规治疗法调控BTNL2-HLA的方式基本类似。由图2可知，除上调BTNL2分子的表达结果外，其对HLA-DQA1及HLA-DRA的表达效果更好。由此推论，脐灸疗法对上述2个HLA分子的抑制效果优于传统疗法，这可能是脐灸疗法优于常规疗法的重要原因。
本研究应用生物信息学方法对BTNL2针对UC治疗的潜在通路进行预测，并对脐灸疗法针对UC治疗过程中BTNL2-HLA所形成的PPI网络的表达情况进行分析，从分子机制层面验证了脐灸疗法疗效优于西药的原因。但本研究所采集的样本较少，且考虑到所选分子均为临床高变异分子，因此在分子机制验证过程中并未引入正常人群样本，可能限制了最终结果的准确性;且本研究仅考察脐灸疗法在治疗UC过程中相应分子的共表达变化趋势，对于其深层机制如二者是否存在调控关系、调控方式如何等未做研究。所得结论有待今后验证。
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（收稿日期：2018-11-13）
（修回日期：2019-03-06;编辑：季巍巍）