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摘要：为探明不同杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内抑菌活性，采用菌丝生长速率法测定12种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力。结果表明，乙霉威、环酰菌胺、嘧菌环胺、咪酰胺、速克灵、多菌灵、烯唑醇、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺、腈菌唑、吡唑醚菌酯对葡萄灰霉病菌的EC50值分别为0.092 8、0.094 0、0.098 1、0.117 4、0.420 4、0.491 8、0.591 7、0861 6、2.611 6、3.266 4、11.371 5、20.573 3 mg/L。葡萄灰霉病菌对不同杀菌剂的敏感性差异较大，其中供试葡萄灰霉病菌对乙霉威最敏感。
关键词：葡萄灰霉病菌；杀菌剂；毒力；菌丝；生长速率法
中图分类号： S436.631.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0124-03
收稿日期：2014-03-31
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2013407）；江苏省镇江市农业科技支撑计划（编号：NY2013014）。
作者简介：陈宏州（1984—），男，壮族，广西宜州人，硕士，助理研究员，主要从事作物病害生物防治及杀菌剂抗药性研究。E-mail：hongzc_2006@126.com。
通信作者：庄义庆，博士，研究员，主要从事植物保护研究。E-mail：yqzhuang@sina.com。由灰葡萄孢菌（Botrytic cinerea Pers.）引起的葡萄灰霉病主要危害葡萄叶片、新鞘、花穗、果实，是世界葡萄生产上的主要病害[1]。该病害不仅在田间为害，在产后贮藏期也是毁灭性病害，每年因灰霉病造成的葡萄产前、产后损失高达50%，一般损失在20%～30%[2]。灰葡萄孢菌腐生性强，寄主范围广，能够侵染400余种植物，在各类作物资源中尚未发现抗病材料，很难培育出抗病品种[3]。目前该病害的防治仍以化学防治为主，但由于灰葡萄孢菌具有遗传变异大、繁殖速率快、适合度高等特点，在连续多年单一使用某种杀菌剂后，极易使病原菌产生抗药性及交互抗性[4]。陈月凤等报道，连续多年使用多菌灵、甲基硫菌灵、速克灵等药剂对葡萄灰霉病已几乎没有防治效果[5]。因此，必须调整对灰霉病菌的防治策略，合理使用杀菌剂，同时也须要开发、引进与推广新药剂。本研究采用菌丝生长速率法测定了12种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力，研究多种新型药剂和常规药剂对葡萄灰霉病菌的抑菌效果，以期为开发防治葡萄灰霉病的新药剂和科学合理地使用杀菌剂提供依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室分离，并保存于4 ℃冰箱中备用。
1.2供试培养基
马铃薯培养基（PDA）[6]用于葡萄灰霉病菌的分离、保存以及毒力测定。
1.3供试药剂
97.09%多菌灵，上海升联化工有限公司；95.2%咪酰胺，江苏辉丰农化股份有限公司；98%速克灵，江西禾益化工有限公司；97.4%异菌脲，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；92%烯唑醇，盐城利民农化有限公司；97.8%腈菌唑，江苏耘农化工有限公司；98.4%环酰菌胺，陕西恒润化学工业有限公司；98.2%嘧霉胺，陕西恒润化学工业有限公司；98.2%嘧菌环胺，陕西恒润化学工业有限公司；84.39%啶酰菌胺，德国巴斯夫股份有限公司；95.4%乙霉威，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；95%吡唑醚菌酯，德国巴斯夫股份有限公司。将9709%多菌灵用适量0.1 mol/L盐酸溶液溶解，其他药剂分别用适量丙酮溶解并加入10%吐温-80，各药剂均配制成 10 g/L 的母液置于4 ℃冰箱中备用。
1.4含药培养基的制备
分别将多菌灵等供试药剂母液依次稀释至一定浓度，再将1 mL药液与9 mL PDA培养基在培养皿内混匀，制成含系列梯度浓度药剂的PDA培养基，各药剂在PDA培养基中的系列梯度浓度见表1，以无菌水作空白对照，每个处理重复4次。
1.5毒力测定
采用菌丝生长速率法[7]，将保留的葡萄灰霉病菌转接到PDA平皿中，在25 ℃下活化3 d，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到上述倍比稀释配制的含药和空白对照的PDA平皿中，25 ℃培养4 d，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。
计算菌落直径均值，并按照下式计算菌丝生长平均抑制率：菌丝生长平均抑制率=（对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）/（对照菌落直径均值-接种菌饼直径）×100%。采用DPS 13.0专业版数据处理系统计算各药剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95%置信限，并以多菌灵EC50值为对照求出相对毒力指数。
2结果与分析
2.112种杀菌剂对葡萄灰霉病菌丝生长的影响
由表1可见，当多菌灵、咪酰胺、速克灵浓度为0.039～表112种杀菌剂对葡萄灰霉病菌菌
2.212种杀菌剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长EC50值的影响
由表2可见，乙霉威、环酰菌胺、嘧菌环胺、咪酰胺、速克灵、多菌灵、烯唑醇、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺、腈菌唑、吡唑醚菌酯对葡萄灰霉病菌菌丝生长的EC50值分别为0.092 8、0094 0、0.098 1、0.117 4、0.420 4、0.491 8、0.591 7、0.861 6、2.611 6、3.266 4、11.371 5、20.573 3 mg/L。12种供试杀菌剂中，乙霉威对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性最强，而吡唑醚菌酯的抑制活性最弱，二者的EC50值相差约221倍。以多菌灵的EC50值为对照，得出不同杀菌剂的相对毒力指数，其中乙霉威、环酰菌胺、嘧菌环胺、咪酰胺、速克灵的相对毒力指数为0.1～0.9，烯唑醇、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺、腈菌唑、吡唑醚菌酯的相对毒力指数分别为1.203 1、1751 9、5.310 3、6.641 7、23.122 2、41.832 7。这表明常规药剂乙霉威以及新型药剂环酰菌胺、嘧菌环胺对供试葡萄灰霉病菌具有较强的室内抑菌活性；而常规药剂多菌灵对供试葡萄灰霉病菌仍有较好的抑制活性，并且优于多种常规药剂以及新型药剂啶酰菌胺、吡唑醚菌酯。表212种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力测定结果 药剂毒力回归方程相关系数
3结论与讨论
化学防治是控制灰霉病的主要措施[8]。防治灰霉病的药剂，从最开始使用的百菌清等多位点杀菌剂，到20世纪70年代的抗微管杀菌剂（多菌灵等），20世纪80年代的渗透调节杀菌剂（速克灵），20世纪90年代的蛋氨酸合成抑制剂（嘧霉胺），到2000年甾醇生物合成抑制剂，然后是近年来开发应用的新型吡啶类杀菌剂（啶酰菌胺）和嘧啶类杀菌剂（嘧菌环胺）等药剂，有关药剂不断更新换代[9-11]。据报道，灰霉病菌对百菌清[12]、多菌灵[13]、速克灵[14]、嘧霉胺[15]均已产生抗药性，其中对多菌灵的抗药性最强。一直以来，灰霉病的防治及其病原菌的抗药性等问题，都引起了各级植保部门的高度关注。
张鹏等研究了速克灵、氟硅唑、咪酰胺、甲基硫菌灵、嘧霉胺、代森锰锌、腈菌唑等7种杀菌剂对葡萄灰霉病的室内抑菌活性，结果表明，50%速克灵可湿性粉剂、60%腈菌唑乳油、40%嘧霉胺可湿性粉剂对葡萄灰霉病具有较强的抑菌作用，其中速克灵抑菌作用最强[16]。本研究采用菌丝生长速率法测定葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）、咪唑类杀菌剂（咪酰胺）、亚胺类杀菌剂（速克灵、异菌脲）、三唑类杀菌剂（烯唑醇、腈菌唑）、酰胺类杀菌剂（环酰菌胺）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（吡唑醚菌酯）、嘧啶类杀菌剂（嘧霉胺、嘧菌环胺）、吡啶类杀菌剂（啶酰菌胺）、氨基甲酸酯类杀菌剂（乙霉威）等9类、12种杀菌剂的室内毒力，结果表明12种杀菌剂对葡萄灰霉病的毒力从大到小依次为乙霉威>环酰菌胺>嘧菌环胺>咪酰胺>速克灵>多菌灵>烯唑醇>异菌脲>嘧霉胺>啶酰菌胺>腈菌唑>吡唑醚菌酯，该结果与以往报道[5，11，16-17]有一定差异，这可能是由于病原菌菌株之间的差异造成的。
本研究表明，新型酰胺类杀菌剂（环酰菌胺）和嘧啶类杀菌剂（嘧菌环胺）对葡萄灰霉病菌有较强的抑制活性，具有较好的推广价值。但在没有明确葡萄灰霉病菌对新杀菌剂抗性风险情况下，在其应用中应该遵循杀菌剂使用准则，与其他不同作用机制的杀菌剂轮换或交替使用，以延缓病菌抗药性的产生。本研究中多种常规药剂尤其是苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）对葡萄灰霉病也具有较好的抑制活性，表明在葡萄灰霉病菌未产生明显抗药性的地区，多菌灵等常规药剂仍具有较好的防治效果，因此建议科学合理使用药剂，延缓常规药剂的使用寿命。
参考文献：
[1]严红，燕继晔，王忠跃，等. 葡萄灰霉病菌对3种杀菌剂的多重抗药性检测[J]. 果树学报，2012，29（4）：625-629.
[2]陈宇飞，文景芝，李立军. 葡萄灰霉病研究进展[J]. 东北农业大学学报，2006，37（5）：693-699.
[3]雷百战，李国英，石在强. 葡萄灰霉病病原鉴定和生物学特性研究[J]. 石河子大学学报：自然科学版，2004，22（增刊）：145-149.
[4]黄启良，李凤敏，王敏. 40%嘧霉胺悬浮剂防治黄瓜灰霉病药效试验[J]. 植物保护，2000，26（2）：44-45.
[5]陈月凤，马丽敏，高豫汝，等. 几种新型杀菌剂对葡萄灰霉病的防治效果[J]. 南京农专学报，2002，18（2）：39-40，56.
[6]赵斌，何绍江. 微生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2002：251.
[7]Schwinn F. Recommended methods for the detection and measurement of resistance of plant pathogens to fung-icides：method for fungicide resistance in tate blight of potato[J]. Plant Protection Bulletin，1982（30）：69-71.
[8]礼茜. 浙江省两地草莓灰霉病菌对异菌脲和嘧霉胺的抗药性评价及其分子机制研究[D]. 杭州：浙江大学，2007.
[9]马晓东. 葡萄灰霉病防治工作的进展及存在问题[J]. 农药译丛，1996，18（3）：53-57.
[10]杨敬辉，陈宏州，吴琴燕，等. 啶酰菌胺对草莓灰霉病菌的毒力测定及田间防效[J]. 江西农业学报，2010，22（9）：94-95，98.
[11]沈迎春. 嘧菌环胺对葡萄灰霉病室内毒力测定和田间药效试验[J]. 农药，2010，49（4）：306-307.
[12]张传清，张雅，魏方林，等. 设施蔬菜灰霉病菌对不同类型杀菌剂的抗性检测[J]. 农药学学报，2006，8（3）：245-249.
[13]周明国，叶钟音，杭建胜，等. 对多菌灵具有抗性的草莓灰霉病菌菌株形成与分布研究[J]. 南京农业大学学报，1990，13（3）：57-60.
[14]刘波，叶钟音，刘经芬，等. 对多菌灵、速克灵具多重抗性的灰霉病菌菌株性质的研究[J]. 南京农业大学学报，1993，16（3）：50-54.
[15]纪明山，祁之秋，王英姿，等. 番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J]. 植物保护学报，2003，30（4）：396-400.
[16]张鹏，刘长远，梁春浩，等. 7种杀菌剂对葡萄灰霉病的室内抑菌活性测定[J]. 园艺与种苗，2012（1）：61-64.
[17]张娜，田淑芬. 几种杀菌剂对葡萄灰霉病的抑制效果研究[J]. 北方园艺，2010（13）：184-186.胡一凤，井涛，王梦颖，等. 抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG-3A1鉴定[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：127-131.
关键词：葡萄灰霉病菌；杀菌剂；毒力；菌丝；生长速率法
中图分类号： S436.631.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0124-03
收稿日期：2014-03-31
基金项目：江苏省科技支撑计划（编号：BE2013407）；江苏省镇江市农业科技支撑计划（编号：NY2013014）。
作者简介：陈宏州（1984—），男，壮族，广西宜州人，硕士，助理研究员，主要从事作物病害生物防治及杀菌剂抗药性研究。E-mail：hongzc_2006@126.com。
通信作者：庄义庆，博士，研究员，主要从事植物保护研究。E-mail：yqzhuang@sina.com。由灰葡萄孢菌（Botrytic cinerea Pers.）引起的葡萄灰霉病主要危害葡萄叶片、新鞘、花穗、果实，是世界葡萄生产上的主要病害[1]。该病害不仅在田间为害，在产后贮藏期也是毁灭性病害，每年因灰霉病造成的葡萄产前、产后损失高达50%，一般损失在20%～30%[2]。灰葡萄孢菌腐生性强，寄主范围广，能够侵染400余种植物，在各类作物资源中尚未发现抗病材料，很难培育出抗病品种[3]。目前该病害的防治仍以化学防治为主，但由于灰葡萄孢菌具有遗传变异大、繁殖速率快、适合度高等特点，在连续多年单一使用某种杀菌剂后，极易使病原菌产生抗药性及交互抗性[4]。陈月凤等报道，连续多年使用多菌灵、甲基硫菌灵、速克灵等药剂对葡萄灰霉病已几乎没有防治效果[5]。因此，必须调整对灰霉病菌的防治策略，合理使用杀菌剂，同时也须要开发、引进与推广新药剂。本研究采用菌丝生长速率法测定了12种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力，研究多种新型药剂和常规药剂对葡萄灰霉病菌的抑菌效果，以期为开发防治葡萄灰霉病的新药剂和科学合理地使用杀菌剂提供依据。
1材料与方法
1.1供试菌株
葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所植保研究室分离，并保存于4 ℃冰箱中备用。
1.2供试培养基
马铃薯培养基（PDA）[6]用于葡萄灰霉病菌的分离、保存以及毒力测定。
1.3供试药剂
97.09%多菌灵，上海升联化工有限公司；95.2%咪酰胺，江苏辉丰农化股份有限公司；98%速克灵，江西禾益化工有限公司；97.4%异菌脲，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；92%烯唑醇，盐城利民农化有限公司；97.8%腈菌唑，江苏耘农化工有限公司；98.4%环酰菌胺，陕西恒润化学工业有限公司；98.2%嘧霉胺，陕西恒润化学工业有限公司；98.2%嘧菌环胺，陕西恒润化学工业有限公司；84.39%啶酰菌胺，德国巴斯夫股份有限公司；95.4%乙霉威，江苏蓝丰生物化工股份有限公司；95%吡唑醚菌酯，德国巴斯夫股份有限公司。将9709%多菌灵用适量0.1 mol/L盐酸溶液溶解，其他药剂分别用适量丙酮溶解并加入10%吐温-80，各药剂均配制成 10 g/L 的母液置于4 ℃冰箱中备用。
1.4含药培养基的制备
分别将多菌灵等供试药剂母液依次稀释至一定浓度，再将1 mL药液与9 mL PDA培养基在培养皿内混匀，制成含系列梯度浓度药剂的PDA培养基，各药剂在PDA培养基中的系列梯度浓度见表1，以无菌水作空白对照，每个处理重复4次。
1.5毒力测定
采用菌丝生长速率法[7]，将保留的葡萄灰霉病菌转接到PDA平皿中，在25 ℃下活化3 d，然后在近菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌饼，并转接到上述倍比稀释配制的含药和空白对照的PDA平皿中，25 ℃培养4 d，待对照中菌落长至约平皿直径的4/5时，采用十字交叉法量取菌落直径。
计算菌落直径均值，并按照下式计算菌丝生长平均抑制率：菌丝生长平均抑制率=（对照菌落直径均值-处理菌落直径均值）/（对照菌落直径均值-接种菌饼直径）×100%。采用DPS 13.0专业版数据处理系统计算各药剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长抑制的回归方程、EC50及其95%置信限，并以多菌灵EC50值为对照求出相对毒力指数。
2结果与分析
2.112种杀菌剂对葡萄灰霉病菌丝生长的影响
由表1可见，当多菌灵、咪酰胺、速克灵浓度为0.039～表112种杀菌剂对葡萄灰霉病菌菌
2.212种杀菌剂对葡萄灰霉病菌菌丝生长EC50值的影响
由表2可见，乙霉威、环酰菌胺、嘧菌环胺、咪酰胺、速克灵、多菌灵、烯唑醇、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺、腈菌唑、吡唑醚菌酯对葡萄灰霉病菌菌丝生长的EC50值分别为0.092 8、0094 0、0.098 1、0.117 4、0.420 4、0.491 8、0.591 7、0.861 6、2.611 6、3.266 4、11.371 5、20.573 3 mg/L。12种供试杀菌剂中，乙霉威对葡萄灰霉病菌菌丝生长的抑制活性最强，而吡唑醚菌酯的抑制活性最弱，二者的EC50值相差约221倍。以多菌灵的EC50值为对照，得出不同杀菌剂的相对毒力指数，其中乙霉威、环酰菌胺、嘧菌环胺、咪酰胺、速克灵的相对毒力指数为0.1～0.9，烯唑醇、异菌脲、嘧霉胺、啶酰菌胺、腈菌唑、吡唑醚菌酯的相对毒力指数分别为1.203 1、1751 9、5.310 3、6.641 7、23.122 2、41.832 7。这表明常规药剂乙霉威以及新型药剂环酰菌胺、嘧菌环胺对供试葡萄灰霉病菌具有较强的室内抑菌活性；而常规药剂多菌灵对供试葡萄灰霉病菌仍有较好的抑制活性，并且优于多种常规药剂以及新型药剂啶酰菌胺、吡唑醚菌酯。表212种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力测定结果 药剂毒力回归方程相关系数
3结论与讨论
化学防治是控制灰霉病的主要措施[8]。防治灰霉病的药剂，从最开始使用的百菌清等多位点杀菌剂，到20世纪70年代的抗微管杀菌剂（多菌灵等），20世纪80年代的渗透调节杀菌剂（速克灵），20世纪90年代的蛋氨酸合成抑制剂（嘧霉胺），到2000年甾醇生物合成抑制剂，然后是近年来开发应用的新型吡啶类杀菌剂（啶酰菌胺）和嘧啶类杀菌剂（嘧菌环胺）等药剂，有关药剂不断更新换代[9-11]。据报道，灰霉病菌对百菌清[12]、多菌灵[13]、速克灵[14]、嘧霉胺[15]均已产生抗药性，其中对多菌灵的抗药性最强。一直以来，灰霉病的防治及其病原菌的抗药性等问题，都引起了各级植保部门的高度关注。
张鹏等研究了速克灵、氟硅唑、咪酰胺、甲基硫菌灵、嘧霉胺、代森锰锌、腈菌唑等7种杀菌剂对葡萄灰霉病的室内抑菌活性，结果表明，50%速克灵可湿性粉剂、60%腈菌唑乳油、40%嘧霉胺可湿性粉剂对葡萄灰霉病具有较强的抑菌作用，其中速克灵抑菌作用最强[16]。本研究采用菌丝生长速率法测定葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）、咪唑类杀菌剂（咪酰胺）、亚胺类杀菌剂（速克灵、异菌脲）、三唑类杀菌剂（烯唑醇、腈菌唑）、酰胺类杀菌剂（环酰菌胺）、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（吡唑醚菌酯）、嘧啶类杀菌剂（嘧霉胺、嘧菌环胺）、吡啶类杀菌剂（啶酰菌胺）、氨基甲酸酯类杀菌剂（乙霉威）等9类、12种杀菌剂的室内毒力，结果表明12种杀菌剂对葡萄灰霉病的毒力从大到小依次为乙霉威>环酰菌胺>嘧菌环胺>咪酰胺>速克灵>多菌灵>烯唑醇>异菌脲>嘧霉胺>啶酰菌胺>腈菌唑>吡唑醚菌酯，该结果与以往报道[5，11，16-17]有一定差异，这可能是由于病原菌菌株之间的差异造成的。
本研究表明，新型酰胺类杀菌剂（环酰菌胺）和嘧啶类杀菌剂（嘧菌环胺）对葡萄灰霉病菌有较强的抑制活性，具有较好的推广价值。但在没有明确葡萄灰霉病菌对新杀菌剂抗性风险情况下，在其应用中应该遵循杀菌剂使用准则，与其他不同作用机制的杀菌剂轮换或交替使用，以延缓病菌抗药性的产生。本研究中多种常规药剂尤其是苯并咪唑类杀菌剂（多菌灵）对葡萄灰霉病也具有较好的抑制活性，表明在葡萄灰霉病菌未产生明显抗药性的地区，多菌灵等常规药剂仍具有较好的防治效果，因此建议科学合理使用药剂，延缓常规药剂的使用寿命。
参考文献：
[1]严红，燕继晔，王忠跃，等. 葡萄灰霉病菌对3种杀菌剂的多重抗药性检测[J]. 果树学报，2012，29（4）：625-629.
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[11]沈迎春. 嘧菌环胺对葡萄灰霉病室内毒力测定和田间药效试验[J]. 农药，2010，49（4）：306-307.
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[14]刘波，叶钟音，刘经芬，等. 对多菌灵、速克灵具多重抗性的灰霉病菌菌株性质的研究[J]. 南京农业大学学报，1993，16（3）：50-54.
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[16]张鹏，刘长远，梁春浩，等. 7种杀菌剂对葡萄灰霉病的室内抑菌活性测定[J]. 园艺与种苗，2012（1）：61-64.
[17]张娜，田淑芬. 几种杀菌剂对葡萄灰霉病的抑制效果研究[J]. 北方园艺，2010（13）：184-186.胡一凤，井涛，王梦颖，等. 抗FOC4香蕉内生放线菌的筛选及菌株NJQG-3A1鉴定[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：127-131.