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摘要 [目的]筛选具有生防潜力的蔬菜灰霉病拮抗菌，为灰霉病的生物防控提供理论基础。[方法]从山东泰安和寿光蔬菜温棚采集根围土壤样本进行菌种的分离，采用生长对峙法筛选灰霉菌拮抗菌株，并测定菌株发酵液对灰霉病菌的抑制作用。[结果]从土壤中分离得到11株拮抗效果较好的细菌，在细菌发酵液拮抗灰霉菌的研究中，筛选出了SG-8.5、SG-1.8和SG-8.3等3株具有抑制作用的菌株。
关键词 设施蔬菜；灰霉病；拮抗菌；生物防治；山东省
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）23-0136-02
Abstract [Objective] To screen the antagonistic bacteria against Botrytis cinerea in vegetable with biocontrol potential，and provide basis for biological control and prevention against Botrytis cinerea.[Method] The rhizosphere soil of protected vegetable was collected from Tai′an and Shouguang in Shandong Province and various soil microorganisms were isolated.Dual culture method was used to screen the microorganism with antagonistic effect against Botrytis cinerea. On this basis，the determination was taken for fermentation broth of antagonistic bacteria against Botrytis cinerea. [Result]Eleven strain of bacterium with relatively good antagonistic effect were isolated from soil. In the study of bacterial fermentation antagonistic against Botrytis cinerea，3 strain were screened out，they were SG-8.5，SG-1.8 and SG-8.3.
Key words protected vegetable；Botrytis cinerea；antagonistic bacteria；biocontrol；Shandong Province
灰霉病是山东地区设施蔬菜发生最严重的三大病害（霜霉病、灰霉病、炭疽病）之一，每年由灰霉病引起的经济损失巨大[1]。蔬菜种植过程中，剧毒农药的大量使用，造成农残超标，食物中毒事件频繁发生[2]，因而蔬菜病害的生物防治更能满足生态农业的需求，成为最有发展潜力的病害防治手段。获得高效的拮抗菌是生物防治的基础，该研究利用生长对峙的方法对蔬菜灰霉病病原菌的拮抗菌株进行了初步筛选，并研究了拮抗菌株的生长性能和拮抗性能，以为蔬菜灰霉病的生物防治提供有力的菌种支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试病原菌：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），由山东农业大学植物保护学院提供。供试土壤样品：采自山东泰安、寿光等地的蔬菜大棚。供试培养基：NA（牛肉膏蛋白胨）培养基、PDA培养基、改良高氏一号培养基（添加高锰酸钾抑制剂）。
1.2 试验方法
1.2.1 拮抗菌株的分离。利用梯度稀释法将土壤样品稀释至10-6～10-2，取稀释液0.2 mL涂布至3种培养基的平板上，静止0.5 h后于28～30 ℃恒温培养箱倒置培养，将单菌落纯化2～3次，镜检菌落的纯度，然后将其转接入斜面4 ℃保存备用。
1.2.2 拮抗菌的筛选。
（1）生长对峙法筛选灰霉病拮抗菌。采用生长对峙培养方法测定分离菌株对病原菌的抑菌效果。在直径9 cm PDA培养皿中央放置病原菌菌苔，在距菌苔3.5 cm的圆周上等距离点接分离细菌，每皿接4点，重复3皿，以不接种细菌的处理为对照，28 ℃恒温培养7 d，观察菌株的抑菌效果，测定菌株的生长直径和抑菌圈直径，对其在培养基上的生长状态、颜色、表面、形状、粗糙度、光泽、边缘形态、透明度、生长状况等进行初步的形态学鉴定。
（2）拮抗菌发酵液的制备。将具有拮抗性能的菌株在NA液体培养基中以28 ℃，150 r/min振荡发酵培养48 h，将发酵液4 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 mm孔径滤膜的细菌滤器过滤得拮抗菌发酵滤液。
（3）拮抗菌发酵液对灰霉病菌的抑制作用。将已灭菌的PDA培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，待其凝固。无菌操作条件下在平板中央放置灰霉病菌菌苔，在距离菌苔3.5 cm的圆周上等距离垂直放置牛津杯（内径6 mm、外径8 mm、高10 mm的圆形小管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，每皿放置4个，在杯中加入240 μL制备好的拮抗菌发酵滤液，勿使其外溢，于30 ℃条件下培养，每天观察并添加牛津杯内的拮抗菌发酵滤液，7 d后观察结果，测定抑菌圈直径。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选结果
经过对所采集的土壤样品进行梯度稀释法分离，共筛选得到了85株菌株，采用平板对峙法对分离得到的菌株进行拮抗性测定，只有较少菌株表现出对灰霉病菌有抑制作用，初步筛选出11株有拮抗性能的菌株，占全部分离菌株的12.9%，根据采样地点对菌株进行编号，分别为SG-1.8、SG-3、SG-8.3、SG-5.3、SG-1.6、SG-5.2、SG-8.5、SG-9.3、LZ-4.6、LZ-4.9、LZ-7.4。拮抗菌株的编号、菌落生长直径和抑菌圈直径如表1所示。筛选得到的11株拮抗菌株的抑菌效果如图1所示。由此表明，筛选得到的各个菌株具有一定的拮抗灰霉菌的能力，从自然环境中筛选的野生菌株，不仅性能优良，而且不会对环境造成破坏。对菌落的颜色、表面、形状、粗糙度、光泽、边缘形态、透明度、生长状况、革兰氏染色以及产芽孢状况等进行形态学观察，其测定结果如表2所示。根据细菌菌株的菌落特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》对细菌菌属进行分类，之后将11株菌株分别鉴定为：SG-1.6为弗拉特氏杆菌，SG-5.3为慢生根瘤杆菌，SG-1.8、SG-5.2和SG-9.3为胶质芽孢杆菌，SG-3和SG-8.3为枯草芽孢杆菌，SG-8.5为短杆芽孢杆菌，LZ-7.4为拜叶林克氏杆菌，LZ-4.6为土壤单胞菌、LZ-4.9为热酸杆菌。
2.2 拮抗菌发酵液抑制灰霉病菌结果
该试验以牛津杯法测定拮抗菌发酵液对灰霉病菌的抑制作用。试验第7天的结果表明，仅有3株菌株SG-8.5、SG-1.8和SG-8.3在发酵48 h时发酵液中含有抑菌物质，对灰霉菌具有抑菌效果（图2）。其余8株所筛选的拮抗菌株纯发酵液对番茄灰霉菌无抑制作用，其作用机理可能是菌体生长的营养竞争抑制了灰霉病菌的生长。
3 结论与讨论
生物防治中拮抗细菌的利用是当今植物病害防治十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景[3]。据报道，拮抗细菌对植物病原真菌的作用机制主要是竞争、拮抗、重寄生和诱导抗性[4]。该试验在离体条件下筛选山东泰安、寿光等大棚土壤的菌株，测定其对灰霉病菌的拮抗作用，得到11株拮抗菌，其中有3株菌株可以分泌抑制灰霉病菌的抑菌物质，其余8株菌株主要通过营养竞争来抑制灰霉病菌的生长，这些菌株在大田条件下对番茄灰霉病的防治效果仍需进一步测定[5-6]。
4 参考文献
[1] 张博，高新昊，李长松，等.山东省寿光日光温室蔬菜病害及农药使用状况[J].中国蔬菜，2012（15）：7-10.
[2] 高中强.山东省设施蔬菜发展现状、问题及对策建议[J].中国蔬菜，2010（2）：12-14.
[3] 祁之秋，王英姿，夏天敏，等.拮抗细菌R26发酵滤液对灰葡萄孢茵的抑茵活性研究[J].河南农业科学，2007（12）：80-82.
[4] 纪明山，李博强，陈捷，等.绿色木霉TR菌株对尖镰孢的拮抗机制[J].中国生物防治，2005，21（2）：104-108.
[5] 张传清，张雅，魏方林，等.设施蔬菜灰霉病菌对不同类型杀菌剂的抗性检测[J].农药学学报，2006（3）：245-249.
[6] 潘争艳，刘伟成，裘季燕，等.放线菌Ⅲ-61和A-21对蔬菜枯萎病和灰霉病的控制作用[J].华北农学报，2005（4）：92-97.
关键词 设施蔬菜；灰霉病；拮抗菌；生物防治；山东省
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）23-0136-02
Abstract [Objective] To screen the antagonistic bacteria against Botrytis cinerea in vegetable with biocontrol potential，and provide basis for biological control and prevention against Botrytis cinerea.[Method] The rhizosphere soil of protected vegetable was collected from Tai′an and Shouguang in Shandong Province and various soil microorganisms were isolated.Dual culture method was used to screen the microorganism with antagonistic effect against Botrytis cinerea. On this basis，the determination was taken for fermentation broth of antagonistic bacteria against Botrytis cinerea. [Result]Eleven strain of bacterium with relatively good antagonistic effect were isolated from soil. In the study of bacterial fermentation antagonistic against Botrytis cinerea，3 strain were screened out，they were SG-8.5，SG-1.8 and SG-8.3.
Key words protected vegetable；Botrytis cinerea；antagonistic bacteria；biocontrol；Shandong Province
灰霉病是山东地区设施蔬菜发生最严重的三大病害（霜霉病、灰霉病、炭疽病）之一，每年由灰霉病引起的经济损失巨大[1]。蔬菜种植过程中，剧毒农药的大量使用，造成农残超标，食物中毒事件频繁发生[2]，因而蔬菜病害的生物防治更能满足生态农业的需求，成为最有发展潜力的病害防治手段。获得高效的拮抗菌是生物防治的基础，该研究利用生长对峙的方法对蔬菜灰霉病病原菌的拮抗菌株进行了初步筛选，并研究了拮抗菌株的生长性能和拮抗性能，以为蔬菜灰霉病的生物防治提供有力的菌种支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试病原菌：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），由山东农业大学植物保护学院提供。供试土壤样品：采自山东泰安、寿光等地的蔬菜大棚。供试培养基：NA（牛肉膏蛋白胨）培养基、PDA培养基、改良高氏一号培养基（添加高锰酸钾抑制剂）。
1.2 试验方法
1.2.1 拮抗菌株的分离。利用梯度稀释法将土壤样品稀释至10-6～10-2，取稀释液0.2 mL涂布至3种培养基的平板上，静止0.5 h后于28～30 ℃恒温培养箱倒置培养，将单菌落纯化2～3次，镜检菌落的纯度，然后将其转接入斜面4 ℃保存备用。
1.2.2 拮抗菌的筛选。
（1）生长对峙法筛选灰霉病拮抗菌。采用生长对峙培养方法测定分离菌株对病原菌的抑菌效果。在直径9 cm PDA培养皿中央放置病原菌菌苔，在距菌苔3.5 cm的圆周上等距离点接分离细菌，每皿接4点，重复3皿，以不接种细菌的处理为对照，28 ℃恒温培养7 d，观察菌株的抑菌效果，测定菌株的生长直径和抑菌圈直径，对其在培养基上的生长状态、颜色、表面、形状、粗糙度、光泽、边缘形态、透明度、生长状况等进行初步的形态学鉴定。
（2）拮抗菌发酵液的制备。将具有拮抗性能的菌株在NA液体培养基中以28 ℃，150 r/min振荡发酵培养48 h，将发酵液4 000 r/min离心30 min，取上清液用0.22 mm孔径滤膜的细菌滤器过滤得拮抗菌发酵滤液。
（3）拮抗菌发酵液对灰霉病菌的抑制作用。将已灭菌的PDA培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，待其凝固。无菌操作条件下在平板中央放置灰霉病菌菌苔，在距离菌苔3.5 cm的圆周上等距离垂直放置牛津杯（内径6 mm、外径8 mm、高10 mm的圆形小管），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，每皿放置4个，在杯中加入240 μL制备好的拮抗菌发酵滤液，勿使其外溢，于30 ℃条件下培养，每天观察并添加牛津杯内的拮抗菌发酵滤液，7 d后观察结果，测定抑菌圈直径。
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选结果
经过对所采集的土壤样品进行梯度稀释法分离，共筛选得到了85株菌株，采用平板对峙法对分离得到的菌株进行拮抗性测定，只有较少菌株表现出对灰霉病菌有抑制作用，初步筛选出11株有拮抗性能的菌株，占全部分离菌株的12.9%，根据采样地点对菌株进行编号，分别为SG-1.8、SG-3、SG-8.3、SG-5.3、SG-1.6、SG-5.2、SG-8.5、SG-9.3、LZ-4.6、LZ-4.9、LZ-7.4。拮抗菌株的编号、菌落生长直径和抑菌圈直径如表1所示。筛选得到的11株拮抗菌株的抑菌效果如图1所示。由此表明，筛选得到的各个菌株具有一定的拮抗灰霉菌的能力，从自然环境中筛选的野生菌株，不仅性能优良，而且不会对环境造成破坏。对菌落的颜色、表面、形状、粗糙度、光泽、边缘形态、透明度、生长状况、革兰氏染色以及产芽孢状况等进行形态学观察，其测定结果如表2所示。根据细菌菌株的菌落特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》对细菌菌属进行分类，之后将11株菌株分别鉴定为：SG-1.6为弗拉特氏杆菌，SG-5.3为慢生根瘤杆菌，SG-1.8、SG-5.2和SG-9.3为胶质芽孢杆菌，SG-3和SG-8.3为枯草芽孢杆菌，SG-8.5为短杆芽孢杆菌，LZ-7.4为拜叶林克氏杆菌，LZ-4.6为土壤单胞菌、LZ-4.9为热酸杆菌。
2.2 拮抗菌发酵液抑制灰霉病菌结果
该试验以牛津杯法测定拮抗菌发酵液对灰霉病菌的抑制作用。试验第7天的结果表明，仅有3株菌株SG-8.5、SG-1.8和SG-8.3在发酵48 h时发酵液中含有抑菌物质，对灰霉菌具有抑菌效果（图2）。其余8株所筛选的拮抗菌株纯发酵液对番茄灰霉菌无抑制作用，其作用机理可能是菌体生长的营养竞争抑制了灰霉病菌的生长。
3 结论与讨论
生物防治中拮抗细菌的利用是当今植物病害防治十分活跃的研究领域之一，并已显示出良好的应用前景[3]。据报道，拮抗细菌对植物病原真菌的作用机制主要是竞争、拮抗、重寄生和诱导抗性[4]。该试验在离体条件下筛选山东泰安、寿光等大棚土壤的菌株，测定其对灰霉病菌的拮抗作用，得到11株拮抗菌，其中有3株菌株可以分泌抑制灰霉病菌的抑菌物质，其余8株菌株主要通过营养竞争来抑制灰霉病菌的生长，这些菌株在大田条件下对番茄灰霉病的防治效果仍需进一步测定[5-6]。
4 参考文献
[1] 张博，高新昊，李长松，等.山东省寿光日光温室蔬菜病害及农药使用状况[J].中国蔬菜，2012（15）：7-10.
[2] 高中强.山东省设施蔬菜发展现状、问题及对策建议[J].中国蔬菜，2010（2）：12-14.
[3] 祁之秋，王英姿，夏天敏，等.拮抗细菌R26发酵滤液对灰葡萄孢茵的抑茵活性研究[J].河南农业科学，2007（12）：80-82.
[4] 纪明山，李博强，陈捷，等.绿色木霉TR菌株对尖镰孢的拮抗机制[J].中国生物防治，2005，21（2）：104-108.
[5] 张传清，张雅，魏方林，等.设施蔬菜灰霉病菌对不同类型杀菌剂的抗性检测[J].农药学学报，2006（3）：245-249.
[6] 潘争艳，刘伟成，裘季燕，等.放线菌Ⅲ-61和A-21对蔬菜枯萎病和灰霉病的控制作用[J].华北农学报，2005（4）：92-97.