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摘 要：利用ITS方法和进化树构建对1株自分离的野生侧耳属真菌进行了分析鉴定，通过单因素试验研究了影响该真菌菌丝生长的环境和营养条件。结果表明：经鉴定，该侧耳属真菌为平菇，宁强平菇菌株与其他平菇菌株亲缘关系远，自分离和选育的镇巴平菇和宁强平菇亲缘关系较远。该平菇菌丝生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为蛋白胨，生长的最佳pH在6.0～6.5，最适温度25℃，最佳碳氮比10∶1。
关键词：菌丝;ITS;平菇
中图分类号 S571.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）11-0040-03
Identification of a Wild Pleurotus ostreatus Strain and its Nutritional Growth Conditions
ZHANG Yaoling1，2 et al.
（1Hanzhong Institute of Agricultural Sciences， Hanzhong 723000， China; 2Quality and Safety of Agricultural Products Inspection Test Center of Yulin， Yulin 719000， China）
Abstract： A self isolated wild Pleurotus fungus was identified by its method and phylogenetic tree construction. Then， the environmental and nutritional conditions affecting the mycelial growth of the fungus were studied by single factor experimental design. The results showed that Pleurotus ostreatus was Pleurotus ostreatus， and Ningqiang Pleurotus ostreatus was far related to other Pleurotus ostreatus strains， and Zhenba Pleurotus ostreatus and Ningqiang Pleurotus ostreatus were far related. The optimal carbon source and nitrogen source for the mycelium growth of Pleurotus ostreatus were sucrose and peptone. The optimal pH range for the mycelium growth was 6.0-6.5， the optimal temperature was 25℃， and the optimal carbon nitrogen ratio was 10∶1.
Key words： Mycelium; ITS; Pleurotus ostreatus
側耳属为一类营养价值和经济价值较高的腐生真菌，在我国栽培种类丰富，范围广，市场占有量大，具有悠久的栽培历史[1]。据研究发现，全世界大概有50种侧耳属具有有效名，图力古尔[2]等初步确定了我国分布有36个侧耳种。在中国栽培的侧耳属真菌包括糙皮侧耳（平菇）、肺形侧耳（秀珍菇）、金顶侧耳（榆黄蘑）等[2]。近年来，分子生物学方法的应用为侧耳属的分类和鉴定带来了便利。为此，笔者从宁强县深山采摘并分离获得一株侧耳属菌株，随后利用ITS方法对其进行了分析和鉴定，对该菌株的菌丝生长适宜条件进行了研究，旨在探索该侧耳属菌株生长适宜的条件，为该菌株的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料 供试野生菌株采自汉中市宁强县，通过组织分离留种，记为宁强菌株。
1.2 试验方法
1.2.1 宁强菌株的分子鉴定 采用PDA复合培养基培养菌丝，CTAB法提取DNA。通用引物ITS1和ITS4各1μL，DNA：1μL，2*Mix：10μL，进行PCR，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，送公司测序。采用软件ClustalW 2.0，进行DNA序列比对，用MEGA 6.0进行系统发育分析，以NJ法构建系统发育树。
1.2.2 菌株最佳营养和环境条件的确定 采用PDA复合培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蛋白胨5g，琼脂粉10g，维生素B1 10mg，加水定容至1L，pH自然）于25℃暗培养菌株。设置了6种碳源处理，6种氮源处理，5种碳氮比处理，4个温度梯度处理和7个pH梯度处理，每个处理作3个平行，具体方法详见文献[3]。
1.2.2.1 碳源 分别添加蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖6种不同供试碳源于PDA复合培养基中，添加量20g/L。
1.2.2.2 氮源 分别添加硝酸钠、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、谷氨酸、蛋白胨6种不同供试氮源于PDA复合培养基中，添加量5g/L。
1.2.2.3 温度 采用PDA复合培养基培养，分别设置15℃、20℃、25℃及30℃4个温度梯度。
1.2.2.4 pH值 采用PDA复合培养基培养，分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。
1.2.2.5 碳氮比 采用PDA复合培养基培养，改变蛋白胨添加量配成碳氮比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培养基，观察不同碳氮比处理对菌丝生长的影响。 1.3 数据处理 采用Micrsoft Excel 2013软件作图，用DPS软件方差分析。
2 结果与分析
2.1 基于ITS序列的进化分析 从图1可以看出，宁强菌株的ITS片段大小为646bp（去除载体两端的多克隆位点序列），将该序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索和比对，获取相似度最高的前15个菌株的ITS序列，这些侧耳属菌株均为平菇（Pleurotus ostreatus），结合宁强菌株的子实体形态特征、菌落形态特征，综合表明宁强菌株为平菇菌株。
从进化树来看，宁强平菇菌株为单独的一个分支，與其他16个平菇菌株的遗传距离远，说明宁强平菇菌株与其他菌株亲缘关系远，菌株KY686259.1与镇巴平菇亲缘关系近，除平菇菌株KY686259.1、镇巴平菇和宁强平菇菌株之外，其他的13个菌株聚类在一个分支上，可能是相似的平菇品种，亲缘关系最近，自分离和选育的镇巴平菇和宁强平菇不在同一分支上，结合两者菌株的子实体形态特征、菌落形态特征差异都较大，说明两者进化距离远，亲缘关系较远。
2.2 不同碳源对宁强平菇菌株生长的影响 宁强平菇菌株的菌丝在6种供试碳源培养基上均能生长，菌丝呈灰白色，均有少量的黄色分泌物，但是在不同碳源培养上，菌丝的生长状况差异较为明显。如表1所示，在淀粉中菌丝生长速度最快，为10.78mm/d，与其他碳源处理之间差异达到极显著水平。其次为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，三者之间有显著性差异。在添加有乳糖的培养基上，菌丝生长最缓慢，为7.32mm/d，但是依然可以促进菌丝长势。综合比较，说明宁强平菇的最适碳源为淀粉，其次为蔗糖。
2.3 不同氮源对宁强平菇菌丝生长的影响 宁强平菇菌丝在6种供试氮源中均边缘整齐，菌丝呈灰白色。如表2所示，在硝酸钠培养基中菌丝生长速率小、菌落长势最差，与其他处理间达到了极显著水平;宁强平菇在添加蛋白胨的培养基上的菌丝长势强壮，生长速率最大，与其他处理间达到了显著水平。牛肉膏、酵母粉和谷氨酸3种氮源，菌丝之间的长势差异不明显。综合比较，蛋白胨是宁强平菇生长的最适氮源。
2.4 不同温度对宁强平菇菌丝生长的影响 宁强平菇菌丝生长和子实体发育的整个过程中，温度是一个重要的环境因子。如图3所示，在15～30℃温度范围内，宁强平菇菌丝都可以生长的，菌丝对温度变化较为明显敏感。其中，15℃时菌丝生长速度最小，15～30℃时时菌丝的生长速度呈增加后降低的趋势，温度为25℃时菌丝的生长速度达到最大，长势最佳。
2.5 不同pH对宁强平菇菌丝生长的影响 由表3可知，培养基pH值对宁强平菇菌丝生长的影响较为显著。pH为6.0～7.0时菌丝长势达到最佳，边缘呈绒毛状且整齐，差异极显著;菌丝长速度在pH为6.5时达到最大，所以pH为6.0～6.5最适宁强平菇菌丝生长。
2.6 不同碳氮比对宁强平菇菌丝生长的影响 由表4可知，宁强平菇菌丝对培养基中碳氮比的变化对较为敏感，在试验范围内，菌丝长势在培养基中碳氮比为10∶1时达到最佳，生长速度达到最大，为10.46mm/d。
3 讨论
宁强平菇菌株与其他16个平菇菌株亲缘关系远，自分离和选育的镇巴平菇和宁强平菇亲缘关系较远。宁强平菇可以利用的碳源很广，通过平板实验筛选出宁强平菇生长的最好的碳源为淀粉，其次为蔗糖，乳糖不适宜宁强平菇生长。在6种供试氮源中，宁强平菇对蛋白胨的利用效果最好，其次是酵母粉和牛肉膏。由于蛋白胨中含有蛋白质、氨基酸、维生素等多种氮源和生长因子，能够满足菌丝对多样营养的需求，进而促进菌丝生长，而无机氮源和氨基酸因其成分单一，难以满足菌丝对微量元素、生长因子等的需求，菌丝生长缓慢[5]。因此，宁强平菇菌丝对蛋白胨的利用优于无机氮源和氨基酸。不同碳氮比处理对菌丝生长也有影响，碳氮比为10∶1能满足菌丝生长对碳氮的要求，菌丝长势最好。综合来看，在15～30℃培养条件下，菌丝均能生长，25℃是宁强平菇菌丝生长的最适温度，最适pH为6.0～6.5。
参考文献
[1]曾东方侧耳物种多样性研究现状[J].食用菌学报，1999，6（2）：60-64.
[2]图力古尔，李玉.我国侧耳属真菌的种类资源及其生态地理分布[J].中国食用菌，2001，20（005）：8-10.
[3]高山.基于nLSU rDNA和ITS序列对侧耳属系统发育关系的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[4]鲍蕊.大球盖菇高产栽培技术研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.
[5]孙瑞泽，张耀玲，王胜宝，等.一株野生侧耳菌种鉴定及生物学特性[J].安徽农学通报，2019（9）：34-37.
[6]郑伟.平菇优良菌株的选育及评价[D].邯郸：河北工程大学，2017.
（责编：张宏民）
关键词：菌丝;ITS;平菇
中图分类号 S571.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）11-0040-03
Identification of a Wild Pleurotus ostreatus Strain and its Nutritional Growth Conditions
ZHANG Yaoling1，2 et al.
（1Hanzhong Institute of Agricultural Sciences， Hanzhong 723000， China; 2Quality and Safety of Agricultural Products Inspection Test Center of Yulin， Yulin 719000， China）
Abstract： A self isolated wild Pleurotus fungus was identified by its method and phylogenetic tree construction. Then， the environmental and nutritional conditions affecting the mycelial growth of the fungus were studied by single factor experimental design. The results showed that Pleurotus ostreatus was Pleurotus ostreatus， and Ningqiang Pleurotus ostreatus was far related to other Pleurotus ostreatus strains， and Zhenba Pleurotus ostreatus and Ningqiang Pleurotus ostreatus were far related. The optimal carbon source and nitrogen source for the mycelium growth of Pleurotus ostreatus were sucrose and peptone. The optimal pH range for the mycelium growth was 6.0-6.5， the optimal temperature was 25℃， and the optimal carbon nitrogen ratio was 10∶1.
Key words： Mycelium; ITS; Pleurotus ostreatus
側耳属为一类营养价值和经济价值较高的腐生真菌，在我国栽培种类丰富，范围广，市场占有量大，具有悠久的栽培历史[1]。据研究发现，全世界大概有50种侧耳属具有有效名，图力古尔[2]等初步确定了我国分布有36个侧耳种。在中国栽培的侧耳属真菌包括糙皮侧耳（平菇）、肺形侧耳（秀珍菇）、金顶侧耳（榆黄蘑）等[2]。近年来，分子生物学方法的应用为侧耳属的分类和鉴定带来了便利。为此，笔者从宁强县深山采摘并分离获得一株侧耳属菌株，随后利用ITS方法对其进行了分析和鉴定，对该菌株的菌丝生长适宜条件进行了研究，旨在探索该侧耳属菌株生长适宜的条件，为该菌株的进一步开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料 供试野生菌株采自汉中市宁强县，通过组织分离留种，记为宁强菌株。
1.2 试验方法
1.2.1 宁强菌株的分子鉴定 采用PDA复合培养基培养菌丝，CTAB法提取DNA。通用引物ITS1和ITS4各1μL，DNA：1μL，2*Mix：10μL，进行PCR，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，送公司测序。采用软件ClustalW 2.0，进行DNA序列比对，用MEGA 6.0进行系统发育分析，以NJ法构建系统发育树。
1.2.2 菌株最佳营养和环境条件的确定 采用PDA复合培养基（马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蛋白胨5g，琼脂粉10g，维生素B1 10mg，加水定容至1L，pH自然）于25℃暗培养菌株。设置了6种碳源处理，6种氮源处理，5种碳氮比处理，4个温度梯度处理和7个pH梯度处理，每个处理作3个平行，具体方法详见文献[3]。
1.2.2.1 碳源 分别添加蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖6种不同供试碳源于PDA复合培养基中，添加量20g/L。
1.2.2.2 氮源 分别添加硝酸钠、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、谷氨酸、蛋白胨6种不同供试氮源于PDA复合培养基中，添加量5g/L。
1.2.2.3 温度 采用PDA复合培养基培养，分别设置15℃、20℃、25℃及30℃4个温度梯度。
1.2.2.4 pH值 采用PDA复合培养基培养，分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。
1.2.2.5 碳氮比 采用PDA复合培养基培养，改变蛋白胨添加量配成碳氮比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的培养基，观察不同碳氮比处理对菌丝生长的影响。 1.3 数据处理 采用Micrsoft Excel 2013软件作图，用DPS软件方差分析。
2 结果与分析
2.1 基于ITS序列的进化分析 从图1可以看出，宁强菌株的ITS片段大小为646bp（去除载体两端的多克隆位点序列），将该序列在NCBI数据库中进行BLAST搜索和比对，获取相似度最高的前15个菌株的ITS序列，这些侧耳属菌株均为平菇（Pleurotus ostreatus），结合宁强菌株的子实体形态特征、菌落形态特征，综合表明宁强菌株为平菇菌株。
从进化树来看，宁强平菇菌株为单独的一个分支，與其他16个平菇菌株的遗传距离远，说明宁强平菇菌株与其他菌株亲缘关系远，菌株KY686259.1与镇巴平菇亲缘关系近，除平菇菌株KY686259.1、镇巴平菇和宁强平菇菌株之外，其他的13个菌株聚类在一个分支上，可能是相似的平菇品种，亲缘关系最近，自分离和选育的镇巴平菇和宁强平菇不在同一分支上，结合两者菌株的子实体形态特征、菌落形态特征差异都较大，说明两者进化距离远，亲缘关系较远。
2.2 不同碳源对宁强平菇菌株生长的影响 宁强平菇菌株的菌丝在6种供试碳源培养基上均能生长，菌丝呈灰白色，均有少量的黄色分泌物，但是在不同碳源培养上，菌丝的生长状况差异较为明显。如表1所示，在淀粉中菌丝生长速度最快，为10.78mm/d，与其他碳源处理之间差异达到极显著水平。其次为蔗糖、葡萄糖、麦芽糖，三者之间有显著性差异。在添加有乳糖的培养基上，菌丝生长最缓慢，为7.32mm/d，但是依然可以促进菌丝长势。综合比较，说明宁强平菇的最适碳源为淀粉，其次为蔗糖。
2.3 不同氮源对宁强平菇菌丝生长的影响 宁强平菇菌丝在6种供试氮源中均边缘整齐，菌丝呈灰白色。如表2所示，在硝酸钠培养基中菌丝生长速率小、菌落长势最差，与其他处理间达到了极显著水平;宁强平菇在添加蛋白胨的培养基上的菌丝长势强壮，生长速率最大，与其他处理间达到了显著水平。牛肉膏、酵母粉和谷氨酸3种氮源，菌丝之间的长势差异不明显。综合比较，蛋白胨是宁强平菇生长的最适氮源。
2.4 不同温度对宁强平菇菌丝生长的影响 宁强平菇菌丝生长和子实体发育的整个过程中，温度是一个重要的环境因子。如图3所示，在15～30℃温度范围内，宁强平菇菌丝都可以生长的，菌丝对温度变化较为明显敏感。其中，15℃时菌丝生长速度最小，15～30℃时时菌丝的生长速度呈增加后降低的趋势，温度为25℃时菌丝的生长速度达到最大，长势最佳。
2.5 不同pH对宁强平菇菌丝生长的影响 由表3可知，培养基pH值对宁强平菇菌丝生长的影响较为显著。pH为6.0～7.0时菌丝长势达到最佳，边缘呈绒毛状且整齐，差异极显著;菌丝长速度在pH为6.5时达到最大，所以pH为6.0～6.5最适宁强平菇菌丝生长。
2.6 不同碳氮比对宁强平菇菌丝生长的影响 由表4可知，宁强平菇菌丝对培养基中碳氮比的变化对较为敏感，在试验范围内，菌丝长势在培养基中碳氮比为10∶1时达到最佳，生长速度达到最大，为10.46mm/d。
3 讨论
宁强平菇菌株与其他16个平菇菌株亲缘关系远，自分离和选育的镇巴平菇和宁强平菇亲缘关系较远。宁强平菇可以利用的碳源很广，通过平板实验筛选出宁强平菇生长的最好的碳源为淀粉，其次为蔗糖，乳糖不适宜宁强平菇生长。在6种供试氮源中，宁强平菇对蛋白胨的利用效果最好，其次是酵母粉和牛肉膏。由于蛋白胨中含有蛋白质、氨基酸、维生素等多种氮源和生长因子，能够满足菌丝对多样营养的需求，进而促进菌丝生长，而无机氮源和氨基酸因其成分单一，难以满足菌丝对微量元素、生长因子等的需求，菌丝生长缓慢[5]。因此，宁强平菇菌丝对蛋白胨的利用优于无机氮源和氨基酸。不同碳氮比处理对菌丝生长也有影响，碳氮比为10∶1能满足菌丝生长对碳氮的要求，菌丝长势最好。综合来看，在15～30℃培养条件下，菌丝均能生长，25℃是宁强平菇菌丝生长的最适温度，最适pH为6.0～6.5。
参考文献
[1]曾东方侧耳物种多样性研究现状[J].食用菌学报，1999，6（2）：60-64.
[2]图力古尔，李玉.我国侧耳属真菌的种类资源及其生态地理分布[J].中国食用菌，2001，20（005）：8-10.
[3]高山.基于nLSU rDNA和ITS序列对侧耳属系统发育关系的研究[D].武汉：华中农业大学，2008.
[4]鲍蕊.大球盖菇高产栽培技术研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2015.
[5]孙瑞泽，张耀玲，王胜宝，等.一株野生侧耳菌种鉴定及生物学特性[J].安徽农学通报，2019（9）：34-37.
[6]郑伟.平菇优良菌株的选育及评价[D].邯郸：河北工程大学，2017.
（责编：张宏民）