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摘要：基于甜瓜属Ty1-copra类逆转座子的长末端重复序列信息，结合ISSR引物序列，在体系优化的基础上建立了适用于甜瓜属物种的REMAP(retrotransposon-一microsatellite amplified polymorphism)标记体系。对46份甜瓜属不同类型材料进行聚类分析，证明该标记体系能有效检测甜瓜属不同类型材料问的多态性，可以用于甜瓜属作物品种鉴定及指纹图谱构建。
关键词：甜瓜属；分子标记；REMAP；多态性
逆转座子(retrotrarsposon)是高等植物中种类最多、分布最广的一类可移动因子，其转座过程以RNA为中间媒介，通过逆转录酶所主导的DNA-RNA-DNA方式转座，每转座1次，其拷贝数就增加1次，从而成为植物基因组的重要组成部分。根据是否具有长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)可将其分为LTR和非LTR两类。目前研究较多的是LTR类逆转座子，是一类异质性很高的群体，以高拷贝数形式出现，广泛存在于所有染色体中，在植物中表现出插入多态性。
逆转座子因具有分布广泛、高度异质性及拷贝数多等特性，使其成为研究植物遗传多样性和进化的理想工具。逆转座子微卫星多态性标记(retro-transposon-microsatellite amplified polymorphism，REMAP)是基于逆转座子LTR序列并结合ISSR开发的应用比较广泛的标记之一。已有研究表明REMAP标记具有谱带丰富、多态性高以及操作简便等优点，在品种鉴定和遗传多样性分析方面具有广泛的应用价值。
甜瓜属包含甜瓜(Cucumis melo IJJ)和黄瓜(C.sativus L.)2种重要经济作物，但其遗传基础狭窄，黄瓜栽培种间的多态性仅为3％-9％，进一步开发多种分子标记体系对于促进甜瓜属植物基因组研究具有重要意义。笔者前期研究发现逆转座子在黄瓜的基因组中分布广泛，并且开发了SSAP标记。虽然SSAP标记能够有效地揭示甜瓜属不同材料间的遗传多样性，但是该标记体系基于酶切和PCR技术，对DNA质量要求较高，且操作步骤繁琐，在一定程度上限制了其应用㈣。因此，进一步开发多态性高、操作简单的标记体系具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
选取来自不同地区、不同生态型的46份甜瓜属材料，其中包括黄瓜近缘野生种C，hystrix及其与栽培黄瓜北京截头杂交加倍后形成的异源四倍体新种C.hytivus(表1)。所用材料均为本实验室多年自交保存资源。
2.2 基于REMAP标记的甜瓜属材料的聚类分析
根据REMAP分子标记引物LTRA-J1和LTRA-J2对材料的检测结果进行统计分析，利用NTSYSpc2，11获得甜瓜属46份材料的聚类图谱，将46份材料分为2个类群(图2)。
第1类群包含27份材料，绝大多数为黄瓜材料，但还包含4份甜瓜材料。该标记能够把遗传距离狭窄的各个黄瓜材料区分开。该类群分为5个亚类，亚类A1含有ECl、EC5、PI 508454、北京截头、黄瓜近缘野生种C.hystrix、黄瓜种间杂交种C.hytivus。其中黄瓜种间杂交种C.hytivus及其双亲北京截头和黄瓜近缘野生种C.hystrix在分支树中分在同一个分支中，表现出极近的亲缘关系。亚类A2中有8份材料，包括PI 508455、二早子、平望、SWCCl0、PI436533、SWCC8、SWCCl2、SWCC9，其中4份西双版纳材料亲缘关系表现出一定的相似度。在亚类A3中含有10份材料。大多为美国生态型及华北生态型材料。其余2个亚类A4和A5均为甜瓜材料，亚类 A4共有2份材料，分别是来自南非的甜瓜PI374152和来自阿富汗的甜瓜PI 324525：亚类A5为俄罗斯甜瓜PI 476332。亚类A4、A5材料与黄瓜有着较近的亲缘关系，
第Ⅱ类群全部为甜瓜材料，分为8个亚类，相互间遗传距离较远，可以清晰地分辨出各个甜瓜材料。亚类B1含有意大利甜瓜PI 136170、加拿大甜瓜PI136229和赞比亚甜瓜PI 500362。亚类B2中，亲缘关系较近的2个中国甜瓜，现在在中国仍然广泛种植，另外2个埃及甜瓜在埃及普遍种植。亚类B3中包含1个埃及甜瓜PI 525115和1个赞比亚甜瓜PI249897。另外亚类B4-B8中材料较少，与其他甜瓜材料亲缘关系也较远。对甜瓜材料聚类分析后发现，甜瓜材料较黄瓜材料相互间亲缘关系较远，遗传变化较大。
3 讨论
根据rrvl-copia类逆转座子的LTR序列设计引物，与ISSR引物组合成REMAP分子标记，建立了适合于甜瓜属材料的REMAP分子标记体系，并应用于甜瓜属不同类型材料间的遗传多样性分析。在前期琼脂糖电泳中检测的条带数量远远低于聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测的数量。REMAP扩增出的谱带在100-750 bp较为集中，弱带较多，根据不同检测方式的比较，认为高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳应优先选择，
为了阐明REMAP扩增谱带的来源，与ISSR单引物的扩增结果进行了比较。试验结果表明，单ISSR引物扩增产物与REMAP标记的扩增产物差别较大。ISSR引物扩增条带主要集中于250-2 000bp，而REMAP标记扩增条带集中于100-750 bp。同时从扩增条带数目来看，ISSR引物在黄瓜材料中共扩增出7条条带，甜瓜材料中扩增出9条条带，远远低于REMAP标记的33条条带。证明REMAP扩增图谱的来源主要是逆转座子和ISSR引物共同作用的结果。
逆转座子标记较常规标记具有灵敏度高、基因组覆盖度广和多态性丰富等特点，尤其适用于种质鉴定、遗传多样性及系统发育分析。笔者利用2对REMAP引物对甜瓜属46份材料进行聚类分析，成功将甜瓜属材料分成2个类群、13个亚类，能够有效区分黄瓜材料和甜瓜材料。其中类群1分为5个亚类，相互间遗传差异率较小，说明了黄瓜材料的遗传变异狭窄。类群Ⅱ分为8个亚类，遗传距离远，甜瓜材料表现出较大的遗传变异。聚类分析表明建立的REMAP分子标记体系可以有效地用于甜瓜属材料的遗传多样性分析。
4 结论
本试验在前期体系优化的基础上建立了适用于甜瓜属材料的REMAP分子标记体系，并通过不同的检测方法比较，确定聚丙酰胺凝胶电泳应优先进择。通过REMAP分子标记体系和ISSR分子标记体系的比较，证实了REMAP谱带是逆转座子和微卫星序列共同作用的结果，并将开发的REMAP标记体系应用于46份甜瓜属材料的遗传多样性分析。建立的甜瓜属REMAP分子标记体系，对进一步开展甜瓜属相关分子生物学研究，如建立高密度遗传图谱、重要目标性状定位、生物多样性与系统进化研究等具有重要意义。
关键词：甜瓜属；分子标记；REMAP；多态性
逆转座子(retrotrarsposon)是高等植物中种类最多、分布最广的一类可移动因子，其转座过程以RNA为中间媒介，通过逆转录酶所主导的DNA-RNA-DNA方式转座，每转座1次，其拷贝数就增加1次，从而成为植物基因组的重要组成部分。根据是否具有长末端重复序列(long terminal repeat，LTR)可将其分为LTR和非LTR两类。目前研究较多的是LTR类逆转座子，是一类异质性很高的群体，以高拷贝数形式出现，广泛存在于所有染色体中，在植物中表现出插入多态性。
逆转座子因具有分布广泛、高度异质性及拷贝数多等特性，使其成为研究植物遗传多样性和进化的理想工具。逆转座子微卫星多态性标记(retro-transposon-microsatellite amplified polymorphism，REMAP)是基于逆转座子LTR序列并结合ISSR开发的应用比较广泛的标记之一。已有研究表明REMAP标记具有谱带丰富、多态性高以及操作简便等优点，在品种鉴定和遗传多样性分析方面具有广泛的应用价值。
甜瓜属包含甜瓜(Cucumis melo IJJ)和黄瓜(C.sativus L.)2种重要经济作物，但其遗传基础狭窄，黄瓜栽培种间的多态性仅为3％-9％，进一步开发多种分子标记体系对于促进甜瓜属植物基因组研究具有重要意义。笔者前期研究发现逆转座子在黄瓜的基因组中分布广泛，并且开发了SSAP标记。虽然SSAP标记能够有效地揭示甜瓜属不同材料间的遗传多样性，但是该标记体系基于酶切和PCR技术，对DNA质量要求较高，且操作步骤繁琐，在一定程度上限制了其应用㈣。因此，进一步开发多态性高、操作简单的标记体系具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
选取来自不同地区、不同生态型的46份甜瓜属材料，其中包括黄瓜近缘野生种C，hystrix及其与栽培黄瓜北京截头杂交加倍后形成的异源四倍体新种C.hytivus(表1)。所用材料均为本实验室多年自交保存资源。
2.2 基于REMAP标记的甜瓜属材料的聚类分析
根据REMAP分子标记引物LTRA-J1和LTRA-J2对材料的检测结果进行统计分析，利用NTSYSpc2，11获得甜瓜属46份材料的聚类图谱，将46份材料分为2个类群(图2)。
第1类群包含27份材料，绝大多数为黄瓜材料，但还包含4份甜瓜材料。该标记能够把遗传距离狭窄的各个黄瓜材料区分开。该类群分为5个亚类，亚类A1含有ECl、EC5、PI 508454、北京截头、黄瓜近缘野生种C.hystrix、黄瓜种间杂交种C.hytivus。其中黄瓜种间杂交种C.hytivus及其双亲北京截头和黄瓜近缘野生种C.hystrix在分支树中分在同一个分支中，表现出极近的亲缘关系。亚类A2中有8份材料，包括PI 508455、二早子、平望、SWCCl0、PI436533、SWCC8、SWCCl2、SWCC9，其中4份西双版纳材料亲缘关系表现出一定的相似度。在亚类A3中含有10份材料。大多为美国生态型及华北生态型材料。其余2个亚类A4和A5均为甜瓜材料，亚类 A4共有2份材料，分别是来自南非的甜瓜PI374152和来自阿富汗的甜瓜PI 324525：亚类A5为俄罗斯甜瓜PI 476332。亚类A4、A5材料与黄瓜有着较近的亲缘关系，
第Ⅱ类群全部为甜瓜材料，分为8个亚类，相互间遗传距离较远，可以清晰地分辨出各个甜瓜材料。亚类B1含有意大利甜瓜PI 136170、加拿大甜瓜PI136229和赞比亚甜瓜PI 500362。亚类B2中，亲缘关系较近的2个中国甜瓜，现在在中国仍然广泛种植，另外2个埃及甜瓜在埃及普遍种植。亚类B3中包含1个埃及甜瓜PI 525115和1个赞比亚甜瓜PI249897。另外亚类B4-B8中材料较少，与其他甜瓜材料亲缘关系也较远。对甜瓜材料聚类分析后发现，甜瓜材料较黄瓜材料相互间亲缘关系较远，遗传变化较大。
3 讨论
根据rrvl-copia类逆转座子的LTR序列设计引物，与ISSR引物组合成REMAP分子标记，建立了适合于甜瓜属材料的REMAP分子标记体系，并应用于甜瓜属不同类型材料间的遗传多样性分析。在前期琼脂糖电泳中检测的条带数量远远低于聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测的数量。REMAP扩增出的谱带在100-750 bp较为集中，弱带较多，根据不同检测方式的比较，认为高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳应优先选择，
为了阐明REMAP扩增谱带的来源，与ISSR单引物的扩增结果进行了比较。试验结果表明，单ISSR引物扩增产物与REMAP标记的扩增产物差别较大。ISSR引物扩增条带主要集中于250-2 000bp，而REMAP标记扩增条带集中于100-750 bp。同时从扩增条带数目来看，ISSR引物在黄瓜材料中共扩增出7条条带，甜瓜材料中扩增出9条条带，远远低于REMAP标记的33条条带。证明REMAP扩增图谱的来源主要是逆转座子和ISSR引物共同作用的结果。
逆转座子标记较常规标记具有灵敏度高、基因组覆盖度广和多态性丰富等特点，尤其适用于种质鉴定、遗传多样性及系统发育分析。笔者利用2对REMAP引物对甜瓜属46份材料进行聚类分析，成功将甜瓜属材料分成2个类群、13个亚类，能够有效区分黄瓜材料和甜瓜材料。其中类群1分为5个亚类，相互间遗传差异率较小，说明了黄瓜材料的遗传变异狭窄。类群Ⅱ分为8个亚类，遗传距离远，甜瓜材料表现出较大的遗传变异。聚类分析表明建立的REMAP分子标记体系可以有效地用于甜瓜属材料的遗传多样性分析。
4 结论
本试验在前期体系优化的基础上建立了适用于甜瓜属材料的REMAP分子标记体系，并通过不同的检测方法比较，确定聚丙酰胺凝胶电泳应优先进择。通过REMAP分子标记体系和ISSR分子标记体系的比较，证实了REMAP谱带是逆转座子和微卫星序列共同作用的结果，并将开发的REMAP标记体系应用于46份甜瓜属材料的遗传多样性分析。建立的甜瓜属REMAP分子标记体系，对进一步开展甜瓜属相关分子生物学研究，如建立高密度遗传图谱、重要目标性状定位、生物多样性与系统进化研究等具有重要意义。