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目的 探讨miRNA原位杂交技术的多种影响因素,以完善miRNA原位杂交分析方法.方法 选择不同组织来源、保存时间、切片厚度的常规病理组织切片进行U6探针的原位杂交分析;选择不同浓度的蛋白酶K对组织切片与MDA-MB-231爬片细胞进行U6探针的原位杂交分析;实时定量RT-PCR方法和爬片细胞原位杂交对BT549、T47D细胞株进行miR-375的表达分析.结果 不同组织来源、保存时间、切片厚度的石蜡标本均能显示细胞核内的U6表达;组织切片原位杂交实验中,乳腺组织切片20 μg/ml的蛋白酶K作用组较其他组的原位杂交效果好;肝脏组织切片200 μg/ml的蛋白酶K作用组的显色最好;爬片细胞原位杂交实验中,2 μg/ml的蛋白酶K作用组的显色更深;U6与miR-375的原位杂交最适浓度分别为1 ng/ml和100 ng/ml;实时定量RT-PCR和爬片细胞原位杂交结果均显示,BT 549的miR-375表达明显低于T47D.结论 miRNA原位杂交操作能在常规固定并长期保存的石蜡组织标本上操作;蛋白酶K与探针的浓度应当依据病理标本类型等多因素预实验摸索;细胞水平的实时定量RT-PCR和爬片细胞原位杂交分析结果的比对为确定miRNA探针的特异性提供了帮助.