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摘要： 建立了检测糕点中三氯蔗糖的超高效液相-串联质谱（UPLC-MS/MS）测方法。样品经亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液去除糕点中蛋白、油脂等杂质后， 用甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱， 采用Aglient Eclipse Plus C18 （3.0×100mm）分离后，用電喷雾负离子（ESI-）模式离子化，选择多反应检测（MRM）方式监测，串联质谱测定，外标法定量。实验结果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范围内呈良好的线性关系， 相关系数为r=0.998， 三氯蔗糖的方法检出限为 0.1μg/kg，回收率为93.8%-97.6%， 相对标准偏差（ RSD） 为1.38%。 本方法快速简便， 操作稳定， 可适用于糕点三氯蔗糖的质量控制检测。
关键词： 三氯蔗糖;超高效液相-串联质谱;干扰少
传统食品工业长期以来主要以糖类作甜味剂，传统糕点中常用的糖类物质如蔗糖、葡萄糖、果糖等。这些糖类甜味物质多呈现高营养性、高安全性、高发热值及低甜度、大添加量的特点，长期大量食用，易引起心血管疾病、肥胖症、糖尿病及龋齿等，严重威胁人体健康。由于我国老龄化程度不断增加，忌糖队伍越来越大，食品将进一步趋于低热量、低糖。因此，开发应用安全健康的低热量、高甜度及具有功能性的非营养性甜味剂，以满足健康、科学饮食需求显得尤为迫切。三氯蔗糖是以蔗糖为原料的功能性的甜味剂，1976年由英国泰莱公司与伦敦大学共同研制并申请专利，具有无能量、高甜度、纯正甜味、安全度高等特点，其甜度可达蔗糖甜度约600倍。美国食品药品监督管理局（FDA）早在1998年批准三氯蔗糖上市之前，参照了100多项实验数据，未发现其在生殖系统，神经系统方面毒性以及未发现诱发癌症的反应。我国1997年正式批准使用三氯蔗糖之前同样经过了一系列的实验证实了其安全性。
三氯蔗糖在我国使用广泛，目前对于三氯蔗糖分析方法主要有高效液相色谱法、离子色谱法和气相色谱-串联质谱法等，现行的国家标准GB 22255-2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》中使用的是高效液相色谱法。由于糕点中成分复杂，气相色谱串联质谱法中前处理需进行衍生化过程繁琐，并且三氯蔗糖的性质较黏，气相色谱仪进样量小容易引起误差导致实验重现性不好;高效液相色谱法测定三氯蔗糖方法检测器稳定时间长，过程复杂。因而应用此方法实验周期长。本文研究缩短提取时间，简化处理过程，检出限低、干扰少适用于糕点中三氯蔗糖检测的需要。
1. 试验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent1290-6460型超高效液相-串联质谱仪;KH3200B型台式超声波清洗器;Direct-Pure UP型纯水机;梅特勒LE204E/02型分析天平;固相萃取柱。
三氯蔗糖标准溶液20mg/mL;甲醇、甲酸、正己烷为HPLC级。
乙酸锌、亚铁氰化钾分析纯。
1.2 仪器工作条件
1.2.1色谱条件
Aglient ZDRBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（3.0mm×100mm），流动相：A为0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液，B为甲醇;柱温35℃，进样量10?L。流动相梯度洗脱程序：0min，A为95%;0-2min，A由95%降至30%;2-3min，A由30%升至50%;3-3.2min，A由50%降至10%;3.2-4.1min，A由10%升至95%;4.1-7.0min，A为95%。流量0.3mL/min。
1.2.2质谱条件
电喷雾电离负离子模式（ESI-）;质谱扫描方式：多反应离子监测（MRM）;脱溶剂气：氮气;碰撞气：氩气;干燥气流量：10L/min;干燥气温度：350℃;毛细管电压：3.0kV;喷雾压力：207KPa。其他质谱参数见表1。其中*为定量离子。
1.3 实验方法
称取粉碎均匀后的固体试样2g精确到0.001g置于50mL离心管中，加入5mL水，旋涡振荡器振荡2min后加入15mL甲醇，继续振荡30s，超声提取20min，然后以8000r/min冷冻离心3min，移取上清液，残渣用75%甲醇再次提取，合并2次提取液，将提取液用30mL正己烷净化后移取下层溶液，将提取液通过依次用5mL甲醇和5mL水活化的固相萃取小柱，再加入1mL水淋洗，待柱中液体完全流出后，用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液。洗脱液于75℃水浴氮吹近干，甲醇定容至1mL，过0.45μm微孔滤膜供液质分析。
2. 结果与分析
2.1 前处理条件的优化
现行GB 22255-2014在样品制备过程中，其转速为3000r/min时间10min。优化条件将转速增为8000r/min冷冻离心3min，样品在低温条件下分层效果更好，不易堵塞净化柱，且能缩短前处理时间。
2.2 质谱条件的优化
实验考察三氯蔗糖正离子模式下，无法产生相应的[M+H]+准分子离子峰，而在ESI负离子模式下有良好的信号，因此选择ESI负离子模式下进行三氯蔗糖的测定。将1ng/mL的标准溶液在负离子模式下进行全扫描，再通过MRN，优化质谱条件，选择最佳子离子，同时优化碰撞能量。最后确定 m/z395.1>358.9作为定性离子对，m/z395.1>35.1作为定量离子对（见表1）。
2.3 校准曲线的绘制
对质量浓度为0.1-3.0ng/mL的标准工作液进行测定，配制质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0ng/mL，绘制线性曲线。得到线性回归方程y=458.16x+16.82，相关系数R2=0.998，线性范围0.1-3.0ng/mL。以S/N=3计，三氯蔗糖的最小检出限为0.1μg/kg，以S/N=10计，该方法的定量检测限为 0.5μg/kg。
2.4 精密度的测定
取1.00ng/mL的标准溶液，按选定的实验条件连续测试6次，相对标准偏差（RSD）%为1.38%。
2.5 加标回收率的测定
称取适量样品，按线性范围分别加入三个浓度的三氯蔗糖标准物质，进行加标回收实验。平均加标回收率为95.3%，测定结果准确可靠，满足日常检测要求。
3. 结果与讨论
本工作建立了测定糕点中三氯蔗糖的超高效液相-串联质谱法，实验结果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范围内呈良好的线性关系， 相关系数为r=0.998，三氯蔗糖的方法检出限为 0.1μg/kg，回收率为93.8%-97.6%，相对标准偏差（RSD）为1.38%。本方法检出限低，回收率、重复性等结果均优于同等条件的气相色谱-质谱联用法和液相色谱法，可满足糕点中三氯蔗糖的检测要求。
关键词： 三氯蔗糖;超高效液相-串联质谱;干扰少
传统食品工业长期以来主要以糖类作甜味剂，传统糕点中常用的糖类物质如蔗糖、葡萄糖、果糖等。这些糖类甜味物质多呈现高营养性、高安全性、高发热值及低甜度、大添加量的特点，长期大量食用，易引起心血管疾病、肥胖症、糖尿病及龋齿等，严重威胁人体健康。由于我国老龄化程度不断增加，忌糖队伍越来越大，食品将进一步趋于低热量、低糖。因此，开发应用安全健康的低热量、高甜度及具有功能性的非营养性甜味剂，以满足健康、科学饮食需求显得尤为迫切。三氯蔗糖是以蔗糖为原料的功能性的甜味剂，1976年由英国泰莱公司与伦敦大学共同研制并申请专利，具有无能量、高甜度、纯正甜味、安全度高等特点，其甜度可达蔗糖甜度约600倍。美国食品药品监督管理局（FDA）早在1998年批准三氯蔗糖上市之前，参照了100多项实验数据，未发现其在生殖系统，神经系统方面毒性以及未发现诱发癌症的反应。我国1997年正式批准使用三氯蔗糖之前同样经过了一系列的实验证实了其安全性。
三氯蔗糖在我国使用广泛，目前对于三氯蔗糖分析方法主要有高效液相色谱法、离子色谱法和气相色谱-串联质谱法等，现行的国家标准GB 22255-2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》中使用的是高效液相色谱法。由于糕点中成分复杂，气相色谱串联质谱法中前处理需进行衍生化过程繁琐，并且三氯蔗糖的性质较黏，气相色谱仪进样量小容易引起误差导致实验重现性不好;高效液相色谱法测定三氯蔗糖方法检测器稳定时间长，过程复杂。因而应用此方法实验周期长。本文研究缩短提取时间，简化处理过程，检出限低、干扰少适用于糕点中三氯蔗糖检测的需要。
1. 试验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent1290-6460型超高效液相-串联质谱仪;KH3200B型台式超声波清洗器;Direct-Pure UP型纯水机;梅特勒LE204E/02型分析天平;固相萃取柱。
三氯蔗糖标准溶液20mg/mL;甲醇、甲酸、正己烷为HPLC级。
乙酸锌、亚铁氰化钾分析纯。
1.2 仪器工作条件
1.2.1色谱条件
Aglient ZDRBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（3.0mm×100mm），流动相：A为0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液，B为甲醇;柱温35℃，进样量10?L。流动相梯度洗脱程序：0min，A为95%;0-2min，A由95%降至30%;2-3min，A由30%升至50%;3-3.2min，A由50%降至10%;3.2-4.1min，A由10%升至95%;4.1-7.0min，A为95%。流量0.3mL/min。
1.2.2质谱条件
电喷雾电离负离子模式（ESI-）;质谱扫描方式：多反应离子监测（MRM）;脱溶剂气：氮气;碰撞气：氩气;干燥气流量：10L/min;干燥气温度：350℃;毛细管电压：3.0kV;喷雾压力：207KPa。其他质谱参数见表1。其中*为定量离子。
1.3 实验方法
称取粉碎均匀后的固体试样2g精确到0.001g置于50mL离心管中，加入5mL水，旋涡振荡器振荡2min后加入15mL甲醇，继续振荡30s，超声提取20min，然后以8000r/min冷冻离心3min，移取上清液，残渣用75%甲醇再次提取，合并2次提取液，将提取液用30mL正己烷净化后移取下层溶液，将提取液通过依次用5mL甲醇和5mL水活化的固相萃取小柱，再加入1mL水淋洗，待柱中液体完全流出后，用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液。洗脱液于75℃水浴氮吹近干，甲醇定容至1mL，过0.45μm微孔滤膜供液质分析。
2. 结果与分析
2.1 前处理条件的优化
现行GB 22255-2014在样品制备过程中，其转速为3000r/min时间10min。优化条件将转速增为8000r/min冷冻离心3min，样品在低温条件下分层效果更好，不易堵塞净化柱，且能缩短前处理时间。
2.2 质谱条件的优化
实验考察三氯蔗糖正离子模式下，无法产生相应的[M+H]+准分子离子峰，而在ESI负离子模式下有良好的信号，因此选择ESI负离子模式下进行三氯蔗糖的测定。将1ng/mL的标准溶液在负离子模式下进行全扫描，再通过MRN，优化质谱条件，选择最佳子离子，同时优化碰撞能量。最后确定 m/z395.1>358.9作为定性离子对，m/z395.1>35.1作为定量离子对（见表1）。
2.3 校准曲线的绘制
对质量浓度为0.1-3.0ng/mL的标准工作液进行测定，配制质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、3.0ng/mL，绘制线性曲线。得到线性回归方程y=458.16x+16.82，相关系数R2=0.998，线性范围0.1-3.0ng/mL。以S/N=3计，三氯蔗糖的最小检出限为0.1μg/kg，以S/N=10计，该方法的定量检测限为 0.5μg/kg。
2.4 精密度的测定
取1.00ng/mL的标准溶液，按选定的实验条件连续测试6次，相对标准偏差（RSD）%为1.38%。
2.5 加标回收率的测定
称取适量样品，按线性范围分别加入三个浓度的三氯蔗糖标准物质，进行加标回收实验。平均加标回收率为95.3%，测定结果准确可靠，满足日常检测要求。
3. 结果与讨论
本工作建立了测定糕点中三氯蔗糖的超高效液相-串联质谱法，实验结果表明：三氯蔗糖在0.1-3.0ng/mL范围内呈良好的线性关系， 相关系数为r=0.998，三氯蔗糖的方法检出限为 0.1μg/kg，回收率为93.8%-97.6%，相对标准偏差（RSD）为1.38%。本方法检出限低，回收率、重复性等结果均优于同等条件的气相色谱-质谱联用法和液相色谱法，可满足糕点中三氯蔗糖的检测要求。