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摘要本研究通过生物测定检测了重庆潼南田间朱砂叶螨种群对5种杀虫杀螨剂的抗药性，并测定了主要代谢酶活性及抗性相关基因的表达量。抗性监测结果显示，朱砂叶螨对联苯肼酯和哒螨灵表现为中等水平抗性，对阿维菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯为低水平抗性。代谢酶活性检测结果显示：田间种群的P450和GST活性明显提高，且多个相关基因的表达也显著上调，而CarE的活性没有显著变化。综上所述，重庆潼南田间朱砂叶螨种群已对联苯肼酯、哒螨灵、阿维菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯产生了不同程度的抗药性，P450和GST活性提高和有关基因过表达是抗性产生的主要原因。
关键词朱砂叶螨;抗性监测;代谢酶;基因表达
中图分类号：S 481.4
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018118
朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus是一种重要的农业害螨，在全世界范围内均有分布，可为害蔬菜、棉花、烟草等多种经济作物。化学防治是防治该螨的主要措施，但由于朱砂叶螨具有繁殖能力强，世代周期短，并且能够孤雌生殖等特点，使其对化学药剂的抗性发展十分迅速[1]。因此有必要通过抗性监测掌握田间朱砂叶螨种群对各种药剂敏感性的变化，分析其抗性发生发展的趋势和规律，为防治过程中选择合适的药剂提供科学依据[3]。
明确有害生物的抗性机制是进行抗性治理的基础。研究发现，靶标基因的点突变是导致害螨对多种农药产生抗性的重要原因之一[46]。而二斑叶螨Tetranychus urticae基因组和朱砂叶螨转录组数据的发表，为研究害螨代谢酶基因功能提供了丰富的信息资源[78]。以朱砂叶螨主要代谢酶的研究为例，沉默P450还原酶基因后可以阻碍整个P450酶系发挥功能，从而导致朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性提高，并且多条P450基因（CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1、CYP389B1，CYP391A1等）在朱砂葉螨对甲氰菊酯的抗性中有协同作用[910]。针对羧酸酯酶（CarE）的研究同样发现相关基因的过表达现象可能介导了朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗药性[11]。此外，谷胱甘肽S转移酶（GST） 在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性、敏感种群间也存在表达差异的现象[12]。
为明确重庆潼南地区田间的朱砂叶螨对常用杀虫杀螨剂的抗性情况，本研究首先对田间种群进行了抗性监测，检测了田间种群对多种药剂的敏感性，然后通过分析代谢酶活性和基因表达的差异，探讨了介导现阶段抗性的主要因素，为深入开展抗性治理工作奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试虫
朱砂叶螨田间种群采自重庆潼南蔬菜基地的豇豆上，在恒温光照培养箱内使用豇豆叶片饲养。饲养条件：温度 （26±1）℃;相对湿度55%～70%;光周期为L∥D=14 h∥10 h，饲养3代待种群数量扩大后进行生物测定。以室内连续饲养超过15年，未施用过任何药剂的室内种群作为相对敏感种群，饲养条件同上。
1.2主要仪器及化学试剂
抗性测定所用原药，包括92%甲氰菊酯（fenpropathrin）、92%丁氟螨酯（cyflumetofen）、95%哒螨灵（pyridaben）、97%联苯肼酯（bifenazate）、95%阿维菌素（abamectin），由四川省食品药品检验所提供;TRIzol，美国Thermo Scientific公司;Dnase、GoTaq qPCR Master Mix，美国Promega公司;PrimeScript RT reagent kit，日本TaKaRa公司;多功能酶标仪，美国Biotech公司;qTOWER实时荧光定量PCR仪，德国Analytik Jena公司。
1.3生物测定
朱砂叶螨生物测定使用药膜法，具体操作步骤如下：
1）制备药膜：用丙酮将待测药剂的原药稀释成4～6个浓度梯度，并通过预试验将死亡率控制在20%～80%，每个浓度设置3个生物学重复。取2 mL配制好的药剂加入2 mL的离心管中，对照则分别加入丙酮和清水。将离心管置于摇床中过夜摇匀形成药膜。随后倒掉管中的药剂，在通风橱中晾干。对照组进行相同的处理。
2）接螨：用毛笔将同一批次3～5日龄的雌成螨挑取至制备好的药膜管中，每管约30头。将离心管置于恒温光照培养箱中，24 h后取出，在解剖镜下检查死亡率。
3）镜检：将离心管中的螨轻轻弹到干净的滤纸上，用毛笔轻触螨体，不动或仅有1～2对足不自主战栗，但无法行动的个体均视为死亡，对照组死亡率在10%以下视为有效测定，并用以计算校正死亡率。数据用SPSS 16.0进行统计分析。
1.4代谢酶活性检测
选取同一批次3～5日龄的雌成螨进行酶活性测定，每个重复挑取约200头雌成螨，所有试验重复3次。粗酶蛋白的提取参照Wang等[13]的方法。将约200头雌成螨置于1.5 mL离心管中，加入1 mL PBS （0.04 mol/L，pH 7.0）于冰水浴中匀浆，匀浆液于10 000 g、4℃离心15 min，取上清液于4℃下保存备用。GST活性测定参考Clark等[4]的方法。于酶标板每孔中加入100 μL CDNB （0.6 mmol/L） 和100 μL GSH （6 mmol/L），混匀后于37℃保温20 min，随后加入100 μL酶液，继续在37℃条件下反应5 min后于340 nm测其OD值的变化量。P450活性测定参考Shi等[10]的方法。在酶标板每孔中加入20 μL酶液，80 μL磷酸钾缓冲液（0.625 mol/L，pH 7.2），200 μL TMBZ （0.01 g TMBZ溶于5 mL甲醇和15 mL 0.25 mol/L，pH 5.0的醋酸钠缓冲液），25 μL H2O2溶液（体积比为3%）。将反应体系置于25℃下反应2 h后，测定450 nm处的OD值。CarE活性测定参考van Asperen等[15]的方法。于酶标板每孔中加入125 μL底物（1 mL 0.03 mol/L αNA和1 mL 10-4 mol/L毒扁豆碱，98 mL 0.04 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液）和25 μL酶液，于30℃放置10 min，然后加入25 μL的显色剂（1%坚固蓝B盐溶液和5% SDS溶液按体积比为2∶5混合），在30℃再放置10 min后测其在600 nm处OD值。使用 SPSS 16.0 软件进行差异显著性分析。 1.5代谢酶基因表达检测
朱砂叶螨RNA提取、基因组DNA去除、反转录等步骤均按照相应试剂盒说明书操作并进行质量检测。采用实时荧光定量PCR方法检测6个P450基因，4个GST基因以及4个CarE基因在田间种群和室内敏感种群之间的表达差异，引物信息见表1。
实时荧光定量PCR采用 SYBR Green法检测，以RSP18为内参基因。反应程序设置为：95℃ 预变性15 s;95℃变性 15 s，60℃退火加延伸30 s，40个循环。实时荧光定量 PCR反应体系为 20 μL，包括：2×SYBR master mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游特异性引物各0.5 μL、无菌去离子水8 μL。所有试验设3个生物学重复，每个生物学重复有2个技术重复。采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量[16]。并用 SPSS 16.0 软件进行显著性分析。
2结果与分析
2.1抗药性测定结果
阿维菌素和丁氟螨酯对朱砂叶螨潼南种群的毒力最高，LC50分别为0.879 mg/L和2.19 mg/L，甲氰菊酯效果最差，LC50为8 014.9 mg/L。与室内敏感种群相比，朱砂叶螨潼南种群对田间施用较多的联苯肼酯和哒螨灵已经产生了明显的抗药性，抗性倍数分别为敏感种群的55.8倍和32.0倍，对阿维菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯表现为低水平抗性。
2.2代谢酶活性检测结果
为明确潼南田间种群对杀螨剂产生抗性的机制，对外源有毒物质代谢的3种重要解毒代谢酶P450、GST、CarE的活性进行了检测，发现田间种群P450、GST的活性均显著高于室内敏感种群，CarE活性虽比敏感种群高，但是未达到显著水平（表3）。该结果表明田间种群对联苯肼酯和哒螨灵抗药性的提高可能是由于其体内P450和GST活性升高所致。
2.3代谢酶基因表达差异分析
2.3.1P450相关基因表达差异
与P450活性相关的基因表达检测结果如图1所示。其中CPR在P450酶系中起着传递电子的作用，是影响整个P450酶系功能的关键因子，通过检测该基因的相对表达量发现，CPR基因在田间种群中的表达量为敏感种群的1.53倍，且差异达到显著水平（P
关键词朱砂叶螨;抗性监测;代谢酶;基因表达
中图分类号：S 481.4
文献标识码：A
DOI：10.16688/j.zwbh.2018118
朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus是一种重要的农业害螨，在全世界范围内均有分布，可为害蔬菜、棉花、烟草等多种经济作物。化学防治是防治该螨的主要措施，但由于朱砂叶螨具有繁殖能力强，世代周期短，并且能够孤雌生殖等特点，使其对化学药剂的抗性发展十分迅速[1]。因此有必要通过抗性监测掌握田间朱砂叶螨种群对各种药剂敏感性的变化，分析其抗性发生发展的趋势和规律，为防治过程中选择合适的药剂提供科学依据[3]。
明确有害生物的抗性机制是进行抗性治理的基础。研究发现，靶标基因的点突变是导致害螨对多种农药产生抗性的重要原因之一[46]。而二斑叶螨Tetranychus urticae基因组和朱砂叶螨转录组数据的发表，为研究害螨代谢酶基因功能提供了丰富的信息资源[78]。以朱砂叶螨主要代谢酶的研究为例，沉默P450还原酶基因后可以阻碍整个P450酶系发挥功能，从而导致朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性提高，并且多条P450基因（CYP392A28、CYP392A26、CYP384A1、CYP389B1，CYP391A1等）在朱砂葉螨对甲氰菊酯的抗性中有协同作用[910]。针对羧酸酯酶（CarE）的研究同样发现相关基因的过表达现象可能介导了朱砂叶螨对丁氟螨酯的抗药性[11]。此外，谷胱甘肽S转移酶（GST） 在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性、敏感种群间也存在表达差异的现象[12]。
为明确重庆潼南地区田间的朱砂叶螨对常用杀虫杀螨剂的抗性情况，本研究首先对田间种群进行了抗性监测，检测了田间种群对多种药剂的敏感性，然后通过分析代谢酶活性和基因表达的差异，探讨了介导现阶段抗性的主要因素，为深入开展抗性治理工作奠定理论基础。
1材料与方法
1.1试虫
朱砂叶螨田间种群采自重庆潼南蔬菜基地的豇豆上，在恒温光照培养箱内使用豇豆叶片饲养。饲养条件：温度 （26±1）℃;相对湿度55%～70%;光周期为L∥D=14 h∥10 h，饲养3代待种群数量扩大后进行生物测定。以室内连续饲养超过15年，未施用过任何药剂的室内种群作为相对敏感种群，饲养条件同上。
1.2主要仪器及化学试剂
抗性测定所用原药，包括92%甲氰菊酯（fenpropathrin）、92%丁氟螨酯（cyflumetofen）、95%哒螨灵（pyridaben）、97%联苯肼酯（bifenazate）、95%阿维菌素（abamectin），由四川省食品药品检验所提供;TRIzol，美国Thermo Scientific公司;Dnase、GoTaq qPCR Master Mix，美国Promega公司;PrimeScript RT reagent kit，日本TaKaRa公司;多功能酶标仪，美国Biotech公司;qTOWER实时荧光定量PCR仪，德国Analytik Jena公司。
1.3生物测定
朱砂叶螨生物测定使用药膜法，具体操作步骤如下：
1）制备药膜：用丙酮将待测药剂的原药稀释成4～6个浓度梯度，并通过预试验将死亡率控制在20%～80%，每个浓度设置3个生物学重复。取2 mL配制好的药剂加入2 mL的离心管中，对照则分别加入丙酮和清水。将离心管置于摇床中过夜摇匀形成药膜。随后倒掉管中的药剂，在通风橱中晾干。对照组进行相同的处理。
2）接螨：用毛笔将同一批次3～5日龄的雌成螨挑取至制备好的药膜管中，每管约30头。将离心管置于恒温光照培养箱中，24 h后取出，在解剖镜下检查死亡率。
3）镜检：将离心管中的螨轻轻弹到干净的滤纸上，用毛笔轻触螨体，不动或仅有1～2对足不自主战栗，但无法行动的个体均视为死亡，对照组死亡率在10%以下视为有效测定，并用以计算校正死亡率。数据用SPSS 16.0进行统计分析。
1.4代谢酶活性检测
选取同一批次3～5日龄的雌成螨进行酶活性测定，每个重复挑取约200头雌成螨，所有试验重复3次。粗酶蛋白的提取参照Wang等[13]的方法。将约200头雌成螨置于1.5 mL离心管中，加入1 mL PBS （0.04 mol/L，pH 7.0）于冰水浴中匀浆，匀浆液于10 000 g、4℃离心15 min，取上清液于4℃下保存备用。GST活性测定参考Clark等[4]的方法。于酶标板每孔中加入100 μL CDNB （0.6 mmol/L） 和100 μL GSH （6 mmol/L），混匀后于37℃保温20 min，随后加入100 μL酶液，继续在37℃条件下反应5 min后于340 nm测其OD值的变化量。P450活性测定参考Shi等[10]的方法。在酶标板每孔中加入20 μL酶液，80 μL磷酸钾缓冲液（0.625 mol/L，pH 7.2），200 μL TMBZ （0.01 g TMBZ溶于5 mL甲醇和15 mL 0.25 mol/L，pH 5.0的醋酸钠缓冲液），25 μL H2O2溶液（体积比为3%）。将反应体系置于25℃下反应2 h后，测定450 nm处的OD值。CarE活性测定参考van Asperen等[15]的方法。于酶标板每孔中加入125 μL底物（1 mL 0.03 mol/L αNA和1 mL 10-4 mol/L毒扁豆碱，98 mL 0.04 mol/L pH 7.0磷酸缓冲液）和25 μL酶液，于30℃放置10 min，然后加入25 μL的显色剂（1%坚固蓝B盐溶液和5% SDS溶液按体积比为2∶5混合），在30℃再放置10 min后测其在600 nm处OD值。使用 SPSS 16.0 软件进行差异显著性分析。 1.5代谢酶基因表达检测
朱砂叶螨RNA提取、基因组DNA去除、反转录等步骤均按照相应试剂盒说明书操作并进行质量检测。采用实时荧光定量PCR方法检测6个P450基因，4个GST基因以及4个CarE基因在田间种群和室内敏感种群之间的表达差异，引物信息见表1。
实时荧光定量PCR采用 SYBR Green法检测，以RSP18为内参基因。反应程序设置为：95℃ 预变性15 s;95℃变性 15 s，60℃退火加延伸30 s，40个循环。实时荧光定量 PCR反应体系为 20 μL，包括：2×SYBR master mix 10 μL、cDNA模板1 μL、上下游特异性引物各0.5 μL、无菌去离子水8 μL。所有试验设3个生物学重复，每个生物学重复有2个技术重复。采用 2-ΔΔCt法计算相对表达量[16]。并用 SPSS 16.0 软件进行显著性分析。
2结果与分析
2.1抗药性测定结果
阿维菌素和丁氟螨酯对朱砂叶螨潼南种群的毒力最高，LC50分别为0.879 mg/L和2.19 mg/L，甲氰菊酯效果最差，LC50为8 014.9 mg/L。与室内敏感种群相比，朱砂叶螨潼南种群对田间施用较多的联苯肼酯和哒螨灵已经产生了明显的抗药性，抗性倍数分别为敏感种群的55.8倍和32.0倍，对阿维菌素、丁氟螨酯和甲氰菊酯表现为低水平抗性。
2.2代谢酶活性检测结果
为明确潼南田间种群对杀螨剂产生抗性的机制，对外源有毒物质代谢的3种重要解毒代谢酶P450、GST、CarE的活性进行了检测，发现田间种群P450、GST的活性均显著高于室内敏感种群，CarE活性虽比敏感种群高，但是未达到显著水平（表3）。该结果表明田间种群对联苯肼酯和哒螨灵抗药性的提高可能是由于其体内P450和GST活性升高所致。
2.3代谢酶基因表达差异分析
2.3.1P450相关基因表达差异
与P450活性相关的基因表达检测结果如图1所示。其中CPR在P450酶系中起着传递电子的作用，是影响整个P450酶系功能的关键因子，通过检测该基因的相对表达量发现，CPR基因在田间种群中的表达量为敏感种群的1.53倍，且差异达到显著水平（P