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【摘要】 目的探讨彩色多普勒超声检测甲状腺乳头状癌(PTC)血流,病理微血管密度(MVD)与颈部淋巴结转移的关系。方法采用彩色多普勒超声检测121例PTC内的血流信号,测量收缩期峰值流速(Vmax)、阻力指数(RI),同时采用免疫组化技术检测肿瘤内以CD105标记的微血管密度(MVD),分析Vmax、RI与MVD的相关性及其和PTC颈部淋巴结转移的关系。结果 PTC的血流检出率(97.68%)显著高于甲状腺滤泡性腺瘤(5%)(连续校正 χ2=33.68,P<0.01),PTC的血流级别也显著高于腺瘤。(似然比值=43.13,P<0.01);PTC的Vmax(75.72±20.62),RI值(0.73±0.14)分别显著高于腺瘤的Vmax(33.80±4.15),RI值(0.35±0.06)(t′=17.74,P<0.01) (t′=19.53,P<0.01);PTC的MVD值(63.0±18.81) 显著高于腺瘤的MVD值(15.73±5.137),(t′=23.39,P<0.01)。有颈部淋巴结转移的76例PTC的MVD值(76.18±4.98)、Vmax(90.24±4.41)及RI(0.82±0.05)分别显著高于无淋巴结转移的45例PTC的MVD值(38.01±3.92)、Vmax(48.10±4.62)及RI(0.56±0.09)(t=-37.03,P<0.01;t=-42.37,P<0.01;t′=-16.03,P<0.01)。而且,MVD与Vmax、MVD与RI和Vmax与RI明显正相关。(r=0.721,P<0.01; r=0.789,P<0.01; r=0.66,P<0.01)。结论 彩色多普勒超声检测PTC的血流参数Vmax、RI与MVD呈正相关,两者一致性反映了PTC的血管生成特性,与其颈部淋巴结转移密切相关,两者的互补性结合可为PTC术前、术后临床诊治,预后判断提供有价值的信息。
【关键词】 超声-检测;彩色多普勒;甲状腺肿瘤;微血管密度CD105
本实验通过分析经彩色多普勒超声检测术前PTC而获得的血流信息与术后PTC病理微血管密度(MVD),颈部淋巴结转移的相关性,探讨其理论和临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集福建医科大学附属泉州第一医院超声科1995年1月至2005年6月术后有病理确诊的121例PTC病例(术前均未接受放疗或化疗),其中女81例,男40例;年龄18～72岁。发现颈部淋巴结转移者76例,标本均为常规制备的石蜡包埋组织,5 μm厚切片,同时选择同期甲状腺滤泡性腺瘤30例。
1.2 彩色多普勒检测PTC内血流情况 采用ALOKA4000彩色多普勒超声诊断仪7.5～10 MHz线阵挥探头,采用特定设置的甲状腺条件,患者取肩高头低的仰卧位,充分暴露颈前部区域,常规横切、纵切甲状腺,观察肿块大小、形态、内部回声,以彩色多普勒血流显像(CDFI)观察占位周边及内部的彩色血流显示及分布情况。根据肿块内部血流分布的形态分为4级[1],0级:无血流信号;Ⅰ级:少血流,1～2个点状血流;Ⅱ级:3～4个点状血流或者1～2条长血管;Ⅲ级:>4个点状血流或>2条长血管,且血管互相连通、交织或网状。然后用脉冲多普勒测量肿块周边及内部的彩色血流收缩期峰值速度(Vmax)、阻力指数(RI),并进行频谱取样。
1.3 免疫组化染色 采用SP法,CD105单克隆抗体,即用型广谱Sp试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司;用微波法修复抗原。以PBS及正常鼠血清代替一抗做阴性对照,以迈新公司提供的阳性切片做阳性对照。严格按照试剂盒所示的操作流程进行染色。
1.4 染色结果判定及MVD的测定 以被CD105抗体染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为1个血管计数,而管腔>8个红细胞直径,带有较厚肌层及硬化区的血管均不被计数。先在40倍光镜下选取新生血管最密集的肿瘤区域,然后在400倍光镜下计数5个视野的微血管数量,由两名病理医师采用双盲法进行计数,结果取其平均值表示每例的MVD值。
1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0统计分析软件,Vmax、RI、MVD值以均数±标准差(x±s)表示,先行Levene方差齐性分析,后作t或t′检验,对应数据的相关分析采用非参数相关性检验(Spearman法),计数资料则作 χ2检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 经彩色多普勒超声检测甲状腺肿瘤内的血流参数与病理MVD的比较 CDFI显示PTC内部彩色血流杂乱,血管丰富,见图1、2,血流检出率97.68%(3/121),Ⅱ、Ⅲ级为主占84.3% (102/121),周边无环绕血流;而在甲状腺滤泡性腺瘤内部与周围正常甲状腺组织的血流信号差异无显著性,血流检出率50%(10/20),Ⅰ级为Ⅰ,占80%(8/10),瘤周边可见环状血流信号。经统计学分析,PTC的血流检出率显著高于腺瘤(连续校正χ2值33.68,P<0.01);PTC的血流级别也显著高于腺瘤(似然比值43,13,P<0.01)。频谱多普勒显示肿瘤内部均可显示动脉血流,PTC的彩色血流属于高速高阻型。它的Vmax(75.72±20.63)、RI值(0.73±0.14)分别显著高于腺瘤的Vmax(33.80±4.15) 、RI值(0.35±0.06),具有统计学意义 (t′=17.74,P<0.01;t′=19.53,P<0.01)。CD105在PTC和滤泡性腺瘤组织中的表达定位于新生血管内皮细胞胞浆,PTC癌细胞、腺瘤腺细胞以及正常甲状腺滤泡上皮细胞对CD105无反应。121例PTC的MVD值为(63.0±18.81),20例滤泡性腺瘤的MVD值为(15.73±5.13),它们之间的MVD差异有显著性(t′=23.39,P<0.01)见表1。
图1
图2
表1
甲状腺肿瘤内血流参数及MVD值的比较(x±s)
肿瘤类型血流检出率血流分级 VmaxRIMVD值
PTC(n=121)97.68%(3/121)Ⅱ～Ⅲ75.75±20.620.63±0.1463.0±18.81
滤泡性腺瘤(n=20)50%(10/20)Ⅰ33.80±4.15 0.3±0.0615.73±5.13
2.2 PTC经彩色多普勒超声检测的血流参数与MVD及颈部淋巴结转移的关系如表2所示,有颈部淋巴结转移的76例PTC的MVD值(76.18±4.98)、Vmax(90.24±4.41)、RI(0.82±0.05)分别显著高于无淋巴结转移的45例PTC的MVD值(38.01±3.92)、Vmax(48.10±4.62)及RI(0.56±0.09),它们的差异有显著性(t=-37.03,P<0.01;t=-42.37,P<0.01;t′=-16.03,P<0.01)。而且,MVD与Vmax、MVD与RI和Vmax与RI明显正相关。(r=0.72,P<0.01;r=0.789,P<0.01;r=0.66,P<0.01)。
表2
PTC颈部淋巴结转移与MVD的关系(x±s)
淋巴结状态 MVDVmax RI
转移76.18±4.9890.24±4.41 0.82±0.05
无转移38.01±3.92 48.10±4.620.56±0.09
P值<0.01
3 讨论
以含纤维血管束的乳头状结构为特点的PTC具有显著的血管新生特征,而且PTC具有强烈的早期淋巴结转移倾向,很多临床检查淋巴结阴性患者其实已存在淋巴结转移。此时潜在淋巴结转移率可能高达60%以上[2]。对乳头状癌是否行预防性颈淋巴结清扫,是临床医师长期争论的焦点,缺乏一种客观的判断指标。一种观点认为对明确的乳头状癌无论有无淋巴结转移,均应实施预防性颈淋巴结清扫;另一种观点主张待淋巴结出现转移再行颈淋巴结清扫,认为对预后并无影响[3]。本组病例的颈淋巴结转移率高达62.8%(76/121),应用彩色多普勒检测PTC的血流状况,同时应用免疫组化学方法检测了PTC中以CD105抗体标记的MVD值,着重分析术前PTC的血流参数,术后PTC的病理MVD值与颈部淋巴结转移的相关性,探讨其理论和临床意义。
血管生成作为肿瘤生态系统中的一个重要因素,参与影响肿瘤的生物学行为,没有营养血管的支持,肿瘤直径会超过2.0 cm[4]。近年来的研究表明肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤组织的血管生成[5]。CDFI显示本组PTC内部彩色血流杂乱、血管丰富,血流检出率显著高于滤泡性腺瘤,且以Ⅱ、Ⅲ级为主;频谱多普勒显示PTC的Vmax、RI明显高于腺瘤,伴淋巴结转移的PTC的Vmax、RI明显高于无淋巴结转移者,存在活跃的血管生成现象。本研究结论佐证了MC CHAMMAS等[6]的观点。这或许能为临床选择施行预防性颈部淋巴结清扫术病例提供某种客观依据,从而避免PTC患者再次手术的痛苦。
CD105位于人染色体q34,它仅强表达于增殖状态的肿瘤组织内新生血管内皮细胞,而在正常组织的血管上几乎无表达[7],据研究认为它比Von Willebrand因子CD31、CD34或Ⅷ因子更具特异性[8-9]。MVD则是表示血管生成活动效应的量化指标[10],本组有淋巴结转移PTC的以CD105抗体标记的MVD值明显高于无淋巴结转移者的MVD值,并且MVD与Vmax、MVD与RI和Vmax与RI明显正相关,说明了彩色多普勒血流检测结果与MVD值具有一致性的态势,它们异曲同工地证实了PTC的血管生成特性与其颈部淋巴结转移密切相关,血管生成活跃者颈部淋巴结转移可能性大,相比之下,后者能更精确地标识瘤组织内的微血管,而前者是对瘤内较大血管彩色血流的定量测估。
MVD检测虽然能用于衡量肿瘤内血管新生的程度,但只适用于对术后标本MVD的回顾性评估,笔者的实验结果证明彩色多普勒超声检测作为一种无创、快捷、可重复的方法,弥补了MVD无法在活体进行检测的缺陷,在判别PTC的血管生成凸现出现其独特的优势。特别是随着超声造影剂及超声检测技术的发展、应用,肿瘤内血流信号更加准确的探测,更能客观地间接反映出肿瘤血管生成状况。总之,PTC彩色血流的多普勒检测和MVD检测,体现了间接与直接,前瞻性与回顾性方法的结合,相得益彰,它们可为PTC的临床诊治、预后判断以及抗血管生成疗效评判等提供较为全面、可靠的信息。
参考文献
[1] 贾启禹,黄珊,段鸿图.彩色多普勒血流显像对甲状腺肿瘤的诊断价值.中国临床医学影像杂志,2004,15(3):137-139.
[2] 高明,葛正津.甲状腺癌诊治进展.肿瘤学杂志,2003,9(1):40-44.
[3] 陈锋夏,钟晓捷,汤鹏.分化型甲状腺癌225例诊治体会.中国现代医学杂志,2002,12(9):51-52.
[4] YANG YJ,LIU JM,WANG BC.Study of relationship betweenVEGF expression and tumor.China Journal of Modem Medicine,2005,15(17):2564-2566,Chinese.
[5] 赵玺龙,姚丽青,孙睿等.微血管密度在宫颈腺癌中的预后意义.中国现代医学杂志,2005,15(16):2453-2456.
[6] CHAMMAS Mc,GERHARD R,DE OLIVEIRA JR,et al.Thyroid nodules:evaluation with power Doppler and duplex ultrasound.Ototaryngol Head Neck Surq,2005,132(6):874-882.
[7] DUFF Se,LI C,GARLAND JM,et al. CD105 is important for angiogenesis:evidence and potential applications.FASEB J,2003,17(9):984-992.
[8] DING S,LI C,LIN S,et al.Comparative evaluation of microvessel density determined by CD34 or CD105 in benign and m alignant gastric lesions.Hum Pathol,2006,37(7):861-866.
[9] YAO Y,KUBOTA T,TAKEUCHI H,et al.prognostic significance of microvessel density determined by an anti-CD105 endoglin monoclonal antibody.Neuropathology,2005,25(3):201-206.
[10] 汤爱国,刘新生,金鑫.奥曲肽对肝癌MVD和VEGF表达影响的实验研究.中国现代医学杂志,2005,15(14):2121-2123.
【关键词】 超声-检测;彩色多普勒;甲状腺肿瘤;微血管密度CD105
本实验通过分析经彩色多普勒超声检测术前PTC而获得的血流信息与术后PTC病理微血管密度(MVD),颈部淋巴结转移的相关性,探讨其理论和临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集福建医科大学附属泉州第一医院超声科1995年1月至2005年6月术后有病理确诊的121例PTC病例(术前均未接受放疗或化疗),其中女81例,男40例;年龄18～72岁。发现颈部淋巴结转移者76例,标本均为常规制备的石蜡包埋组织,5 μm厚切片,同时选择同期甲状腺滤泡性腺瘤30例。
1.2 彩色多普勒检测PTC内血流情况 采用ALOKA4000彩色多普勒超声诊断仪7.5～10 MHz线阵挥探头,采用特定设置的甲状腺条件,患者取肩高头低的仰卧位,充分暴露颈前部区域,常规横切、纵切甲状腺,观察肿块大小、形态、内部回声,以彩色多普勒血流显像(CDFI)观察占位周边及内部的彩色血流显示及分布情况。根据肿块内部血流分布的形态分为4级[1],0级:无血流信号;Ⅰ级:少血流,1～2个点状血流;Ⅱ级:3～4个点状血流或者1～2条长血管;Ⅲ级:>4个点状血流或>2条长血管,且血管互相连通、交织或网状。然后用脉冲多普勒测量肿块周边及内部的彩色血流收缩期峰值速度(Vmax)、阻力指数(RI),并进行频谱取样。
1.3 免疫组化染色 采用SP法,CD105单克隆抗体,即用型广谱Sp试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司;用微波法修复抗原。以PBS及正常鼠血清代替一抗做阴性对照,以迈新公司提供的阳性切片做阳性对照。严格按照试剂盒所示的操作流程进行染色。
1.4 染色结果判定及MVD的测定 以被CD105抗体染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇为1个血管计数,而管腔>8个红细胞直径,带有较厚肌层及硬化区的血管均不被计数。先在40倍光镜下选取新生血管最密集的肿瘤区域,然后在400倍光镜下计数5个视野的微血管数量,由两名病理医师采用双盲法进行计数,结果取其平均值表示每例的MVD值。
1.5 统计学方法 采用SPSS 11.0统计分析软件,Vmax、RI、MVD值以均数±标准差(x±s)表示,先行Levene方差齐性分析,后作t或t′检验,对应数据的相关分析采用非参数相关性检验(Spearman法),计数资料则作 χ2检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 经彩色多普勒超声检测甲状腺肿瘤内的血流参数与病理MVD的比较 CDFI显示PTC内部彩色血流杂乱,血管丰富,见图1、2,血流检出率97.68%(3/121),Ⅱ、Ⅲ级为主占84.3% (102/121),周边无环绕血流;而在甲状腺滤泡性腺瘤内部与周围正常甲状腺组织的血流信号差异无显著性,血流检出率50%(10/20),Ⅰ级为Ⅰ,占80%(8/10),瘤周边可见环状血流信号。经统计学分析,PTC的血流检出率显著高于腺瘤(连续校正χ2值33.68,P<0.01);PTC的血流级别也显著高于腺瘤(似然比值43,13,P<0.01)。频谱多普勒显示肿瘤内部均可显示动脉血流,PTC的彩色血流属于高速高阻型。它的Vmax(75.72±20.63)、RI值(0.73±0.14)分别显著高于腺瘤的Vmax(33.80±4.15) 、RI值(0.35±0.06),具有统计学意义 (t′=17.74,P<0.01;t′=19.53,P<0.01)。CD105在PTC和滤泡性腺瘤组织中的表达定位于新生血管内皮细胞胞浆,PTC癌细胞、腺瘤腺细胞以及正常甲状腺滤泡上皮细胞对CD105无反应。121例PTC的MVD值为(63.0±18.81),20例滤泡性腺瘤的MVD值为(15.73±5.13),它们之间的MVD差异有显著性(t′=23.39,P<0.01)见表1。
图1
图2
表1
甲状腺肿瘤内血流参数及MVD值的比较(x±s)
肿瘤类型血流检出率血流分级 VmaxRIMVD值
PTC(n=121)97.68%(3/121)Ⅱ～Ⅲ75.75±20.620.63±0.1463.0±18.81
滤泡性腺瘤(n=20)50%(10/20)Ⅰ33.80±4.15 0.3±0.0615.73±5.13
2.2 PTC经彩色多普勒超声检测的血流参数与MVD及颈部淋巴结转移的关系如表2所示,有颈部淋巴结转移的76例PTC的MVD值(76.18±4.98)、Vmax(90.24±4.41)、RI(0.82±0.05)分别显著高于无淋巴结转移的45例PTC的MVD值(38.01±3.92)、Vmax(48.10±4.62)及RI(0.56±0.09),它们的差异有显著性(t=-37.03,P<0.01;t=-42.37,P<0.01;t′=-16.03,P<0.01)。而且,MVD与Vmax、MVD与RI和Vmax与RI明显正相关。(r=0.72,P<0.01;r=0.789,P<0.01;r=0.66,P<0.01)。
表2
PTC颈部淋巴结转移与MVD的关系(x±s)
淋巴结状态 MVDVmax RI
转移76.18±4.9890.24±4.41 0.82±0.05
无转移38.01±3.92 48.10±4.620.56±0.09
P值<0.01
3 讨论
以含纤维血管束的乳头状结构为特点的PTC具有显著的血管新生特征,而且PTC具有强烈的早期淋巴结转移倾向,很多临床检查淋巴结阴性患者其实已存在淋巴结转移。此时潜在淋巴结转移率可能高达60%以上[2]。对乳头状癌是否行预防性颈淋巴结清扫,是临床医师长期争论的焦点,缺乏一种客观的判断指标。一种观点认为对明确的乳头状癌无论有无淋巴结转移,均应实施预防性颈淋巴结清扫;另一种观点主张待淋巴结出现转移再行颈淋巴结清扫,认为对预后并无影响[3]。本组病例的颈淋巴结转移率高达62.8%(76/121),应用彩色多普勒检测PTC的血流状况,同时应用免疫组化学方法检测了PTC中以CD105抗体标记的MVD值,着重分析术前PTC的血流参数,术后PTC的病理MVD值与颈部淋巴结转移的相关性,探讨其理论和临床意义。
血管生成作为肿瘤生态系统中的一个重要因素,参与影响肿瘤的生物学行为,没有营养血管的支持,肿瘤直径会超过2.0 cm[4]。近年来的研究表明肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤组织的血管生成[5]。CDFI显示本组PTC内部彩色血流杂乱、血管丰富,血流检出率显著高于滤泡性腺瘤,且以Ⅱ、Ⅲ级为主;频谱多普勒显示PTC的Vmax、RI明显高于腺瘤,伴淋巴结转移的PTC的Vmax、RI明显高于无淋巴结转移者,存在活跃的血管生成现象。本研究结论佐证了MC CHAMMAS等[6]的观点。这或许能为临床选择施行预防性颈部淋巴结清扫术病例提供某种客观依据,从而避免PTC患者再次手术的痛苦。
CD105位于人染色体q34,它仅强表达于增殖状态的肿瘤组织内新生血管内皮细胞,而在正常组织的血管上几乎无表达[7],据研究认为它比Von Willebrand因子CD31、CD34或Ⅷ因子更具特异性[8-9]。MVD则是表示血管生成活动效应的量化指标[10],本组有淋巴结转移PTC的以CD105抗体标记的MVD值明显高于无淋巴结转移者的MVD值,并且MVD与Vmax、MVD与RI和Vmax与RI明显正相关,说明了彩色多普勒血流检测结果与MVD值具有一致性的态势,它们异曲同工地证实了PTC的血管生成特性与其颈部淋巴结转移密切相关,血管生成活跃者颈部淋巴结转移可能性大,相比之下,后者能更精确地标识瘤组织内的微血管,而前者是对瘤内较大血管彩色血流的定量测估。
MVD检测虽然能用于衡量肿瘤内血管新生的程度,但只适用于对术后标本MVD的回顾性评估,笔者的实验结果证明彩色多普勒超声检测作为一种无创、快捷、可重复的方法,弥补了MVD无法在活体进行检测的缺陷,在判别PTC的血管生成凸现出现其独特的优势。特别是随着超声造影剂及超声检测技术的发展、应用,肿瘤内血流信号更加准确的探测,更能客观地间接反映出肿瘤血管生成状况。总之,PTC彩色血流的多普勒检测和MVD检测,体现了间接与直接,前瞻性与回顾性方法的结合,相得益彰,它们可为PTC的临床诊治、预后判断以及抗血管生成疗效评判等提供较为全面、可靠的信息。
参考文献
[1] 贾启禹,黄珊,段鸿图.彩色多普勒血流显像对甲状腺肿瘤的诊断价值.中国临床医学影像杂志,2004,15(3):137-139.
[2] 高明,葛正津.甲状腺癌诊治进展.肿瘤学杂志,2003,9(1):40-44.
[3] 陈锋夏,钟晓捷,汤鹏.分化型甲状腺癌225例诊治体会.中国现代医学杂志,2002,12(9):51-52.
[4] YANG YJ,LIU JM,WANG BC.Study of relationship betweenVEGF expression and tumor.China Journal of Modem Medicine,2005,15(17):2564-2566,Chinese.
[5] 赵玺龙,姚丽青,孙睿等.微血管密度在宫颈腺癌中的预后意义.中国现代医学杂志,2005,15(16):2453-2456.
[6] CHAMMAS Mc,GERHARD R,DE OLIVEIRA JR,et al.Thyroid nodules:evaluation with power Doppler and duplex ultrasound.Ototaryngol Head Neck Surq,2005,132(6):874-882.
[7] DUFF Se,LI C,GARLAND JM,et al. CD105 is important for angiogenesis:evidence and potential applications.FASEB J,2003,17(9):984-992.
[8] DING S,LI C,LIN S,et al.Comparative evaluation of microvessel density determined by CD34 or CD105 in benign and m alignant gastric lesions.Hum Pathol,2006,37(7):861-866.
[9] YAO Y,KUBOTA T,TAKEUCHI H,et al.prognostic significance of microvessel density determined by an anti-CD105 endoglin monoclonal antibody.Neuropathology,2005,25(3):201-206.
[10] 汤爱国,刘新生,金鑫.奥曲肽对肝癌MVD和VEGF表达影响的实验研究.中国现代医学杂志,2005,15(14):2121-2123.