【摘 要】
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目的 构建过表达人类白细胞抗原G5(HLA-G5)慢病毒载体,筛选建立稳定表达HLA-G5的JAR稳转细胞株.方法 根据HLA-G5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片
【机 构】
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成都中医药大学 医学技术学院,四川 成都611137;德阳市人民医院 检验科,四川 德阳618000
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目的 构建过表达人类白细胞抗原G5(HLA-G5)慢病毒载体,筛选建立稳定表达HLA-G5的JAR稳转细胞株.方法 根据HLA-G5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片段.将目的基因定向接入经BamHI/AgeI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒GV492-HLA-G5.筛选阳性克隆和测序鉴定后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒GV492-HLA-G5和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装及纯化并测定病毒滴度.设置过表达实验(OE)组和阴性对照(NC)组,在感染复数为20的条件下感染JAR细胞.用荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白的表达情况.用浓度为2μg·mL-1嘌呤霉素筛选出稳定表达HLA-G5的JAR细胞株.用qRT-PCR和Western blot法检测JAR细胞中HLA-G5的mRNA和蛋白表达水平.结果 经PCR及测序鉴定证明,序列与设计序列一致,成功构建重组慢病毒载体.病毒滴度结果显示,OE组的滴度为2×108 TU·mL-1,NC组的滴度为4×108 TU·mL-1.qRT-PCR显示OE组JAR细胞中HLA-G5的mRNA(108.69±4.25)表达水平较NC组(1.00±0.76)明显增高(P<0.01).Western blot显示OE组JAR细胞中HLA-G5的蛋白(65.84±14.11)表达水平较NC组(1.35±0.37)明显升高(P<0.01).结论 成功构建HLA-G5慢病毒载体并筛选建立JAR-HLA-G5稳转细胞株.
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