【摘 要】
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为了筛选靶向DNA连接酶IV的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶IV的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物.筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理.结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生
【机 构】
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动物胚胎工程与分子育种湖北重点实验室/湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉 430064
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为了筛选靶向DNA连接酶IV的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶IV的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物.筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理.结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复,不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶;经过小分子化合物处理,抑制了细胞内的NHEJ,提高了HDR效率,能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶.使用nocodazole、Methylene blue和Fisetin处理后的萤火虫荧光素酶检测结果65256.3、53713和77058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果41905.3的1.6、1.3和1.8倍,是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果10120的6.4、5.3和7.6倍.证明所用的筛选策略正确,所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligase IV抑制活性的抑制剂,为后续研究奠定了基础.
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