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摘 要：（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[（R）-CHBE]和（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[（S）-CHBE]分别是L-肉碱和阿伐他汀关键中间体。这组对映体的合成，受到国内外学术界的广泛关注。本文从手性催化剂不对称催化氢化，脱卤酶催化的脱卤环合反应，微生物不对称拆分，生物催化不对称还原,手性前体合成五个方面，阐述（R）-CHBE和（S）-CHBE的合成进展，并展望了工业化应用前景。
关键词:4-氯-3-羟基丁酸乙酯;（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；不对称还原;手性合成
L-肉碱（L-carnitine）也称左旋肉碱，作为脂肪酸运输的载体，以乙酰基L-肉碱的形式将中长链脂肪酸，从细胞线粒体膜外转移到膜内，在线粒体基质中氧化产生能量。当人体运动或体力消耗促使能量需求增加时，L-肉碱加速了把人体积累脂肪往细胞线粒体膜内的“搬运”，促进了脂肪的代谢，而达到减肥效果。由于L-肉碱对人体的安全性，良好的降脂减肥效果，以及对心脏良好的保健作用，治疗老年性痴呆症和男性不育症都有良好效果，L-肉碱成为风靡全世界的减肥药和功能保健品，在2010年我国的消费量出现爆发性的增长。
以(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(R)-CHBE]作为起始原料，是合成L-肉碱最简便的工艺路线[1]，因此L-肉碱的合成，最核心的技术问题是如何获取高ee值的(R)-CHBE。
阿伐他汀是羟甲戊二酰辅酶A (HMG．CoA)还原酶抑制剂，通过选择性抑制肝脏中胆固醇合成的限速酶HMG．CoA还原酶，因而使血浆中胆固醇水平下降，还可以降低低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)、升高高密度脂蛋白(HDL)，从而对动脉粥样硬化和冠心病的防治有重要意义。阿伐他汀由Pfizer公司开发，自1997年率先在英国上市，全世界销售额一直保持处方药的首位，2004年达到106.8亿美元[2]，2007年达136.73亿美[3]。
目前国内降脂和降胆固醇药以辛伐他汀为主，阿伐他汀因其适应症更广、耐受性和安全性更好，随着第一份专利保护期到2009年9月到期[4]，阿伐他汀的合成技术已经引起国内各制药企业的广泛关注，在阿伐他汀手性侧链有两个羟基，是与HMGCoA还原酶识别的药效团，合成该侧链涉及的关键中间体是(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE)]，学术界对(S)-CHBE合成技术展开了多方面的研究。
鉴于(R)-CHBE和(S)-CHBE这一组对映体在合成L-肉碱和阿伐他汀的重要意义，作者在此综述近几年国内外对这两个关键中间体的合成进展。
1 (R)-CHBE合成进展
1.1 手性催化剂不对称催化氢化
4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）可方便地由乙烯酮氯化获得[5]，1988年M.Kit－amura[6]以COBE为原料，进行羰基不对称氢化，获得高光学纯度的(R)-CHBE。采用0.05％mol的Ru(OCOMe)2[（S）-binap]为催化剂，在10MPa，100℃下反应5min，获得的(R)-CHBE收率达到97％，对映体过量值(ee)97%。
2002年Cheng-Chao Pai等[7]采用Ru[(R-Bisbenzodioxan-
Phos)Cl2（DMF）n]作为不对称氢化催化剂，在50ml的压力釜中，反应氢压为0.345MPa,在乙醇溶剂存在下，0.2molCOBE，0.5mg手性催化剂，在80－90℃反应124h。得到(R)-CHBE产物对映体过量值(ee)97%。COBE转化率100％。
1.2 脱卤酶催化的脱卤环合反应
Shimizu等[8]采用筛选的一株大肠杆菌EnterobacterDS-S-75对rac-4-氯-3-羟基丁酸乙酯进行不对称转化，可以同时得到对映体过量值(ee)大于99%的(R)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯和对映体过量值(ee)为95.9% 的(S)-3-羟基-γ－丁内酯，两个对映体的转化率均达到48 ％，并已放大到15 m3规模的工业生产。在此研究基础上，Tsushi等成功构建了转基因工程菌[9]Escher-chia coli DH5a，与Enterobacter DSS-75相比，该基因工程菌可提高反应速度近20倍，并且使耐受底物含量由8％提高到15％ 。
1.3 微生物不对称拆分
脂肪酶催化拆分消旋体是一种制备具有光学活性手性化合物的常用方法。金勇等[10]以二氧六环作溶剂，商品脂肪酶Novozym435氨解反应,拆分(rac)- CHBE，获得[R]－CHBE,并同时获得[S]- 4-氯－3－羟基丁酰胺。反应中需要的氨气由氨基甲酸铵缓慢分解提供。在底物浓度达到80 g/L ，30℃ 反应35 h，[R]－CHBE的光学纯度为99％（ee）、转化率为57.7 ％。可惜该文献没有披露S构型酰胺的ee值。
1.4 生物催化不对称还原
大肠杆菌不具备还原COBE的能力，可将专一还原COBE生成(R)-CHBE的酶的基因从供体细胞中克隆出来并转化到大肠杆菌中表达，从而获得高光学纯度的(R)-CHBE，敬科举等[11]采用基因工程技术，从赭色掷孢酵母(Sporobolom-
yces salmonicolor ZJU0105)中克隆出NADPH 依賴型醛基还原酶基因，构建了重组大肠杆菌E．coli BL21(pET28一ALR105)。加入构建的工程菌40 g /L(湿菌体)，葡萄糖0．1 mol／L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)0.2 mmol／L)，葡萄糖脱氢酶(GDH)10 U／ml，底物COBE10g/L。在pH6.0，30℃ 下振荡反应6 h。得到的结果是:底物COBE的转化率99.5%，CHBE收率95.5％，对映体过量值（ee）99.0％。存在的关键问题是必需添加价格昂贵的NADPH，允许加入的底物浓度距离工业化使用的经济要求还有较大差距。 为了避免使用NADPH和GDH这两种价格昂贵的酶，李静等[12]在进一步研究中，从赭色掷孢酵母中克隆出醛基还原酶(NADP-dependent aldehyde reductase)基因(ALR)， 从巨大芽孢杆菌(Bacillus megat-eriumZJUO310)中克隆出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate -dehydrogenase)基因(gdh223)，利用这两种基因构建重组大肠杆菌E.coli M15(pQE30-ALRgdh223)作为催化剂。在转化温度32℃,反应时间为30 h，E.coli M15(pQE30一ALRgdh223)浓度为60 g／L，磷酸钾缓冲溶液浓度1O0 mol／L，pH值6.0，葡萄糖浓度100 mmol／L，为克服由于底物对还原反应有抑制作用采用分批加料方式，最终加入COBE的总量为20g／L时, COBE的转化率为74.7%，反应液中R-CHBE的浓度14.6g/L，收率为73 %，ee值达99%，该研究的技术进步是实现辅酶再生,既不需要额外添加价格昂贵的NADPH和GDH，又可解决采用常规酵母作催化剂时产物对映体过量值(ee)较低的问题。但是虽然采用分批加料方式，反应液中R-CHBE的含量得到一定的提高，但对工业应用还存在较大差距。
2 (S)-CHBE合成进展
2.1 以手性前体合成
Hollingsworth等[13] 从手性3-羟基-γ-丁内酯开始，经过开环、酯化制备得到(R)-BrHBE，收率为9O%。
美国SK能量化学公司的研究人员[14]通过工艺改进，选用乙酰溴作为酰化剂并控制反应pH值8～9.5，可显著减少副反应，使4－羟基丁烯酸乙酯副产物含量由10%降低到2%。
赵诚昱等[15]以手性环氧氯丙烷为原料合成了手性(S)-CHBE。手性环氧氯丙烷经过氰化开环，得到的腈经水解然后酯化得到目标产物。
在深入研究了pH值对氰化开环反应的影响后，发现当反应溶液为酸性时，生成大量的3，4－二羟基丁腈和1，3－二氯异丙醇；当反应溶液为碱性时，则容易产生3，4－环氧丁腈，后者可进一步转变为4－羟基巴豆腈。为了尽量减少副反应的发生，氰化开环反应的pH值宜控制在7．3～7．8。而在酯化反应中，将4－氯－3－羟基丁腈溶解在醇溶剂中并鼓泡通人HCl 气体，就可以迅速地制备需要的高纯度羧酸酯。
2.2 微生物催化手性合成
Chartrain等[16]采用筛选得到一株木兰假丝酵母(Candida magno-liae)，在水／乙酸正丁酯两相体系中，添加葡萄糖、NADPH和GDH，并控制反应过程pH值的条件下，产物(S)-CHBE在有机相中的积累浓度可达9Og/L，ee值达到96.6%。Shimizu S.[17]等把表达了葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌与微生物Candida magnoliae细胞混合，在水／乙酸正丁酯两相体系中，催化COBE羰基还原，底物COBE加入浓度为9O g/L ，按化学计量比转化成(S)一CHBE，产物的光学纯度达到96％（ee）。相较于Chartrain等的研究，不必在微生物催化反应中添加价格昂贵的NADPH和GDH，并且获得高的底物转化率和高的光学纯度。这是目前微生物手性催还原C0BE制备S-CHBE最高水平的报道。
我国近年来采用微生物手性催化还原COBE合成S－CHBE的研究也很活跃，开展研究的主要是江南大学和浙江大学。钟萍等[18]筛选得到对映选择性较好的菌株短梗霉(Au-
reobasidiumpullulans)SW0202。利用该菌进行COBE生物催化的不对称还原，无需添加辅酶NAD(P)H。通过流加或分次添加底物的方法，减小了底物的抑制作用，提高了转化率。在优化反应条件下：初始菌体浓度0．32 g／mL(以湿菌体计)，底物浓度20 g／L，pH 7．0，温度30℃。获得产物(S)－CHBE浓度达
20.32 g／L，摩尔转化率为79.6％．转化产物经硅胶柱层析及减压蒸馏提纯，产品纯度为98．23％,对映体过量值ee为97.8％。江南大学何军邀[19]以出芽短梗霉（ureobasidium pull-
ulans)SW0202细胞作为手性催化剂，在水／邻苯二甲酸二丁酯两相体系中催化COBE不对称还原生成(S)-CHBE。在水与有机溶剂邻苯二甲酸二丁酯的相体积比1：1，反应温度30℃，pH为7．0，振摇速度180 r·min的优化工艺条件下， COBE转化率94．8％,产物(S) -CHBE的累计浓度达58.2 g/L,光学过量值达到了97.9％，这是文献报道的国内最好水平。
3 结语
在L-肉碱关键中间体(R)-CHBE合成中，采用手性钌催化剂进行不对称化学加氢，虽然可获得前体的高转化率和产物的高光学纯度，但存在的最大问题是手性钌催化剂的价格昂贵，占生产原料成本的比例高，难于达到工业生产成本的竞争优势。国外开发的脱卤酶催化的脱卤环合反应，获得了高底物浓度，高转化率和产品的高光学纯度，并已实现半工业化规模，因此是很有前景方法。国内开发的微生物催化氨拆分技术，微生物手性氢化还原合成(R)-CHBE方法 ，也显现出良好的前景，今后重点的研究方向必须在保证底物高转化率和产物的高光学纯度前提下，解决好底物浓度提高对微生物催化转化的抑制问题，努力提高产物的累积浓度，才可取得工业生产的成本优势。
在阿伐他汀主要中间体（S)-CHBE的合成中，以手性前体作为起始原料，是目前工业生产的主要方法。但是手性前体价格高，占原料成本的比例高，限制了该工艺技术的进一步发展。江南大学开发的
在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，微生物手性还原COBE合成（S)-CHBE技术，不需要添加价格昂贵的辅酶，较好的解决了底物浓度提高对微生物转化的抑制，获得较高的底物转化率、产物累积浓度、光学纯度。是很有工業应用前景的（S)-CHBE合成方法。 參考文献
[1]Bing-nanZhou,Aravamudan S.[J].J.Am.Chem.Soc，1983,105：5925-5926.
[2] 任吉民，张立．他汀类降脂药物市场浅析.上海医药[J]，2005,26(7):313-3l4.
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关键词:4-氯-3-羟基丁酸乙酯;（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；不对称还原;手性合成
L-肉碱（L-carnitine）也称左旋肉碱，作为脂肪酸运输的载体，以乙酰基L-肉碱的形式将中长链脂肪酸，从细胞线粒体膜外转移到膜内，在线粒体基质中氧化产生能量。当人体运动或体力消耗促使能量需求增加时，L-肉碱加速了把人体积累脂肪往细胞线粒体膜内的“搬运”，促进了脂肪的代谢，而达到减肥效果。由于L-肉碱对人体的安全性，良好的降脂减肥效果，以及对心脏良好的保健作用，治疗老年性痴呆症和男性不育症都有良好效果，L-肉碱成为风靡全世界的减肥药和功能保健品，在2010年我国的消费量出现爆发性的增长。
以(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(R)-CHBE]作为起始原料，是合成L-肉碱最简便的工艺路线[1]，因此L-肉碱的合成，最核心的技术问题是如何获取高ee值的(R)-CHBE。
阿伐他汀是羟甲戊二酰辅酶A (HMG．CoA)还原酶抑制剂，通过选择性抑制肝脏中胆固醇合成的限速酶HMG．CoA还原酶，因而使血浆中胆固醇水平下降，还可以降低低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)、升高高密度脂蛋白(HDL)，从而对动脉粥样硬化和冠心病的防治有重要意义。阿伐他汀由Pfizer公司开发，自1997年率先在英国上市，全世界销售额一直保持处方药的首位，2004年达到106.8亿美元[2]，2007年达136.73亿美[3]。
目前国内降脂和降胆固醇药以辛伐他汀为主，阿伐他汀因其适应症更广、耐受性和安全性更好，随着第一份专利保护期到2009年9月到期[4]，阿伐他汀的合成技术已经引起国内各制药企业的广泛关注，在阿伐他汀手性侧链有两个羟基，是与HMGCoA还原酶识别的药效团，合成该侧链涉及的关键中间体是(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE)]，学术界对(S)-CHBE合成技术展开了多方面的研究。
鉴于(R)-CHBE和(S)-CHBE这一组对映体在合成L-肉碱和阿伐他汀的重要意义，作者在此综述近几年国内外对这两个关键中间体的合成进展。
1 (R)-CHBE合成进展
1.1 手性催化剂不对称催化氢化
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2002年Cheng-Chao Pai等[7]采用Ru[(R-Bisbenzodioxan-
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1.2 脱卤酶催化的脱卤环合反应
Shimizu等[8]采用筛选的一株大肠杆菌EnterobacterDS-S-75对rac-4-氯-3-羟基丁酸乙酯进行不对称转化，可以同时得到对映体过量值(ee)大于99%的(R)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯和对映体过量值(ee)为95.9% 的(S)-3-羟基-γ－丁内酯，两个对映体的转化率均达到48 ％，并已放大到15 m3规模的工业生产。在此研究基础上，Tsushi等成功构建了转基因工程菌[9]Escher-chia coli DH5a，与Enterobacter DSS-75相比，该基因工程菌可提高反应速度近20倍，并且使耐受底物含量由8％提高到15％ 。
1.3 微生物不对称拆分
脂肪酶催化拆分消旋体是一种制备具有光学活性手性化合物的常用方法。金勇等[10]以二氧六环作溶剂，商品脂肪酶Novozym435氨解反应,拆分(rac)- CHBE，获得[R]－CHBE,并同时获得[S]- 4-氯－3－羟基丁酰胺。反应中需要的氨气由氨基甲酸铵缓慢分解提供。在底物浓度达到80 g/L ，30℃ 反应35 h，[R]－CHBE的光学纯度为99％（ee）、转化率为57.7 ％。可惜该文献没有披露S构型酰胺的ee值。
1.4 生物催化不对称还原
大肠杆菌不具备还原COBE的能力，可将专一还原COBE生成(R)-CHBE的酶的基因从供体细胞中克隆出来并转化到大肠杆菌中表达，从而获得高光学纯度的(R)-CHBE，敬科举等[11]采用基因工程技术，从赭色掷孢酵母(Sporobolom-
yces salmonicolor ZJU0105)中克隆出NADPH 依賴型醛基还原酶基因，构建了重组大肠杆菌E．coli BL21(pET28一ALR105)。加入构建的工程菌40 g /L(湿菌体)，葡萄糖0．1 mol／L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)0.2 mmol／L)，葡萄糖脱氢酶(GDH)10 U／ml，底物COBE10g/L。在pH6.0，30℃ 下振荡反应6 h。得到的结果是:底物COBE的转化率99.5%，CHBE收率95.5％，对映体过量值（ee）99.0％。存在的关键问题是必需添加价格昂贵的NADPH，允许加入的底物浓度距离工业化使用的经济要求还有较大差距。 为了避免使用NADPH和GDH这两种价格昂贵的酶，李静等[12]在进一步研究中，从赭色掷孢酵母中克隆出醛基还原酶(NADP-dependent aldehyde reductase)基因(ALR)， 从巨大芽孢杆菌(Bacillus megat-eriumZJUO310)中克隆出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate -dehydrogenase)基因(gdh223)，利用这两种基因构建重组大肠杆菌E.coli M15(pQE30-ALRgdh223)作为催化剂。在转化温度32℃,反应时间为30 h，E.coli M15(pQE30一ALRgdh223)浓度为60 g／L，磷酸钾缓冲溶液浓度1O0 mol／L，pH值6.0，葡萄糖浓度100 mmol／L，为克服由于底物对还原反应有抑制作用采用分批加料方式，最终加入COBE的总量为20g／L时, COBE的转化率为74.7%，反应液中R-CHBE的浓度14.6g/L，收率为73 %，ee值达99%，该研究的技术进步是实现辅酶再生,既不需要额外添加价格昂贵的NADPH和GDH，又可解决采用常规酵母作催化剂时产物对映体过量值(ee)较低的问题。但是虽然采用分批加料方式，反应液中R-CHBE的含量得到一定的提高，但对工业应用还存在较大差距。
2 (S)-CHBE合成进展
2.1 以手性前体合成
Hollingsworth等[13] 从手性3-羟基-γ-丁内酯开始，经过开环、酯化制备得到(R)-BrHBE，收率为9O%。
美国SK能量化学公司的研究人员[14]通过工艺改进，选用乙酰溴作为酰化剂并控制反应pH值8～9.5，可显著减少副反应，使4－羟基丁烯酸乙酯副产物含量由10%降低到2%。
赵诚昱等[15]以手性环氧氯丙烷为原料合成了手性(S)-CHBE。手性环氧氯丙烷经过氰化开环，得到的腈经水解然后酯化得到目标产物。
在深入研究了pH值对氰化开环反应的影响后，发现当反应溶液为酸性时，生成大量的3，4－二羟基丁腈和1，3－二氯异丙醇；当反应溶液为碱性时，则容易产生3，4－环氧丁腈，后者可进一步转变为4－羟基巴豆腈。为了尽量减少副反应的发生，氰化开环反应的pH值宜控制在7．3～7．8。而在酯化反应中，将4－氯－3－羟基丁腈溶解在醇溶剂中并鼓泡通人HCl 气体，就可以迅速地制备需要的高纯度羧酸酯。
2.2 微生物催化手性合成
Chartrain等[16]采用筛选得到一株木兰假丝酵母(Candida magno-liae)，在水／乙酸正丁酯两相体系中，添加葡萄糖、NADPH和GDH，并控制反应过程pH值的条件下，产物(S)-CHBE在有机相中的积累浓度可达9Og/L，ee值达到96.6%。Shimizu S.[17]等把表达了葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌与微生物Candida magnoliae细胞混合，在水／乙酸正丁酯两相体系中，催化COBE羰基还原，底物COBE加入浓度为9O g/L ，按化学计量比转化成(S)一CHBE，产物的光学纯度达到96％（ee）。相较于Chartrain等的研究，不必在微生物催化反应中添加价格昂贵的NADPH和GDH，并且获得高的底物转化率和高的光学纯度。这是目前微生物手性催还原C0BE制备S-CHBE最高水平的报道。
我国近年来采用微生物手性催化还原COBE合成S－CHBE的研究也很活跃，开展研究的主要是江南大学和浙江大学。钟萍等[18]筛选得到对映选择性较好的菌株短梗霉(Au-
reobasidiumpullulans)SW0202。利用该菌进行COBE生物催化的不对称还原，无需添加辅酶NAD(P)H。通过流加或分次添加底物的方法，减小了底物的抑制作用，提高了转化率。在优化反应条件下：初始菌体浓度0．32 g／mL(以湿菌体计)，底物浓度20 g／L，pH 7．0，温度30℃。获得产物(S)－CHBE浓度达
20.32 g／L，摩尔转化率为79.6％．转化产物经硅胶柱层析及减压蒸馏提纯，产品纯度为98．23％,对映体过量值ee为97.8％。江南大学何军邀[19]以出芽短梗霉（ureobasidium pull-
ulans)SW0202细胞作为手性催化剂，在水／邻苯二甲酸二丁酯两相体系中催化COBE不对称还原生成(S)-CHBE。在水与有机溶剂邻苯二甲酸二丁酯的相体积比1：1，反应温度30℃，pH为7．0，振摇速度180 r·min的优化工艺条件下， COBE转化率94．8％,产物(S) -CHBE的累计浓度达58.2 g/L,光学过量值达到了97.9％，这是文献报道的国内最好水平。
3 结语
在L-肉碱关键中间体(R)-CHBE合成中，采用手性钌催化剂进行不对称化学加氢，虽然可获得前体的高转化率和产物的高光学纯度，但存在的最大问题是手性钌催化剂的价格昂贵，占生产原料成本的比例高，难于达到工业生产成本的竞争优势。国外开发的脱卤酶催化的脱卤环合反应，获得了高底物浓度，高转化率和产品的高光学纯度，并已实现半工业化规模，因此是很有前景方法。国内开发的微生物催化氨拆分技术，微生物手性氢化还原合成(R)-CHBE方法 ，也显现出良好的前景，今后重点的研究方向必须在保证底物高转化率和产物的高光学纯度前提下，解决好底物浓度提高对微生物催化转化的抑制问题，努力提高产物的累积浓度，才可取得工业生产的成本优势。
在阿伐他汀主要中间体（S)-CHBE的合成中，以手性前体作为起始原料，是目前工业生产的主要方法。但是手性前体价格高，占原料成本的比例高，限制了该工艺技术的进一步发展。江南大学开发的
在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，微生物手性还原COBE合成（S)-CHBE技术，不需要添加价格昂贵的辅酶，较好的解决了底物浓度提高对微生物转化的抑制，获得较高的底物转化率、产物累积浓度、光学纯度。是很有工業应用前景的（S)-CHBE合成方法。 參考文献
[1]Bing-nanZhou,Aravamudan S.[J].J.Am.Chem.Soc，1983,105：5925-5926.
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