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目的 观察腺病毒介导的人EGF(Ad-hEGF)基因转染人表皮细胞的合适条件及转染对该细胞生物学特性的影响. 方法 取包皮环切术后弃用的新鲜人体包皮组织,通过酶消化法分离人表皮细胞,传代培养,采用第3代细胞进行以下实验.(1)按随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为未转染组及5、20、50、100、150、200倍转染组,每组3孔.未转染组不转染Ad-hEGF基因,后6组分别按感染复数(MOI)5、20、50、100、150、200转染Ad-hEGF基因.转染24、48、72 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态,倒置荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白表达.(2)另取3个批次细胞,分别同前分组处理,分别于转染24、48、72 h,流式细胞仪检测Ad-hEGF基因转染率(样本数为3),ELISA法检测收集的细胞培养上清液中EGF质量浓度(样本数为6),细胞计数试剂盒8(CCK8)及酶标仪检测细胞增殖活性(样本数为6).(3)另取细胞分为未转染组和转染组,每组6 孔.未转染组用未转染细胞的细胞培养上清液孵育,转染组用以最佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因细胞的细胞培养上清液孵育,分别于孵育1、3、5 d,CCK8及酶标仪检测细胞分泌的EGF生物活性.(4)另取细胞分为未转染组和转染组,每组12孔.未转染组不转染Ad-hEGF基因,转染组以最佳MOI(50)转染Ad-hEGF基因.转染24 h,免疫荧光染色法检测细胞角蛋白14(CK14)、CK19表达.(5)另取细胞,同(4)分组(每组6孔)处理,于划痕后0(即刻)、12、24、48 h,倒置相差显微镜下观测细胞迁移距离.对数据行析因设计方差分析、重复测量方差分析、LSD检验. 结果 (1)转染24、48 h,各转染组细胞形态与未转染组比较,无明显改变;转染72 h,200倍转染组的细胞碎片较未转染组明显增多.转染24、48、72 h,未转染组细胞未见绿色荧光蛋白表达,各转染组绿色荧光蛋白阳性细胞数随转染时间延长逐渐增多.(2)各转染组细胞Ad-hEGF基因转染率随转染时间延长逐渐增高.转染72 h,50～ 200倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率均大于90％;未转染组及5、20倍转染组细胞Ad-hEGF基因转染率则分别为(0.51±0.20)％、(62.44±6.23)％、(75.00±5.43)％,明显低于50倍转染组的(93.12±2.55)％,P值均小于0.01.随着转染时间的延长,各转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度逐渐增高;转染72 h,50倍转染组细胞培养上清液中EGF质量浓度明显高于其余各组(P值均小于0.01).转染24、48 h,各组细胞增殖活性相近(P值均大于0.05);转染72 h,200倍转染组细胞增殖活性明显低于其余各组(P值均小于0.05).(3)孵育1d,2组细胞分泌的EGF生物活性相近(P＞0.05);孵育3、5d,转染组细胞分泌的EGF生物活性明显高于未转染组(P值均小于0.01).(4)转染24 h,转染组细胞CK14、CK19表达较未转染组增强.(5)划痕后0h,2组细胞划痕宽度基本一致.划痕后12～48 h,转染组细胞迁移距离明显长于未转染组(P值均小于0.01). 结论 Ad-hEGF基因转染人表皮细胞的合适MOI为50～ 150,以50为最佳,以此MOI转染既能高效表达目的基因,又可保持细胞良好的增殖、分化和迁移能力.