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摘 要 本文建立了离子交换固相萃取，液相色谱串联质谱检测生物检材中士的宁类生物碱的检验方法。方法：士的宁类生物碱样品试样用OASISMCX3cc（60mg）固相萃取柱富集、分离、净化后，过0.45 m 滤膜，经HyPuRiTY C18 ODS 2.1mm€？50m分离后，梯度洗脱，采用电喷雾电离源正离子模式（ESI ）在多反应监测（MRM）模式下分析检测。结果生物检材中士的宁类的检出限（LOD）为0.8ng/ml-1.0ng/ml。添加回收率为70.2%-94.6%，相对标准偏差小于5%。结论：该方法简便、准确、灵敏，可用于刑事中毒案件中的士的宁类检材的检验需要。
关键词 固相萃取 高效液相色谱-电喷雾串联质谱 生物碱 士的宁 马钱子碱
作者简介：江卓、李婧，安徽省公安厅物证鉴定中心；苏昀，宣城市公安局物证鉴定中心。
中图分类号：D918 文献标识码：A DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2016.11.134
士的宁和马钱子碱是常见的生物碱，士的宁（strychnine）又称番木鳖碱，与马钱子碱（brucine）共存于马前属的许多植物中。
士的宁是一种中枢兴奋剂，医疗上常用作芭比胺类药物中毒解毒剂，在民间常用来毒鼠和禽兽。马钱子碱主要用于化学试剂，医疗上用作治疗中风引起的神经麻痹症及作为健胃药。本文采用血、尿两种生物检材，使用离子交换固相萃取结合液相色谱串联质谱联用作为检测手段，分别考查士的宁和马钱子碱的提取率，得到了较为满意的结果。
一、材料与方法
（一）仪器、试剂与材料
LXQ液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）。
减压抽滤真空泵 AP-01P型（天津奥特赛恩仪器有限公司生产）。
低速离心机80-2型（上海手术器械厂生产）。
电热恒温水浴锅LSY型（北京市医疗设备厂生产）。
士的宁，马钱子碱，SKF525A标准品（公安部物证鉴定中心），配置成1.0mg/mL的储备液于冰箱保存。
新鲜全血浆（购于哈尔滨市呼兰区供血站），尿（正常成人）。
甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司生产）。
碳酸铵，乙酸铵，甲酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，浓氨水，浓盐酸均为分析纯。
OASISMCX 3cc（60mg）固相萃取柱，购至美国Waters公司。
（二）方法
1.样品前处理：
使用3.0mL甲醇，3.0mL去离子水依次过柱，再用3.0mL pH 5.0缓冲溶液过柱，使液体匀速通过小柱。待柱子平衡后，取1.0mL 血（尿）添加2.0mLpH5.0缓冲溶液后上柱，控制流速为1.0mL/min。然后用1.0mL 0.1mol/mL盐酸溶液过柱后，再用2.0mL去离子水淋洗杂质，挤干小柱填充物。再用4.0mL甲醇：氨水（90∶ 10）洗脱，控制流速为1.0mL/min，待小柱内液体流至近干，加压挤干小柱填充物。收集洗脱液，添加10.0 L 100.0 g/mLSKF525A。放置于70℃水浴中挥至近干，浓缩后用甲醇定容至1.0mL。0.45 m滤膜过滤后，取3.0 L注入LC-MS/MS，根据内标标准曲线法定量检测。
2.色谱条件液相色谱条件：
液相柱Thermo公司 HyPuRiTY C18 ODS 2.1mm€？50mm Column.流速0.200ml/min，采集时间控制15min，进样3.0 L。流动相：A：甲醇，B：5mmol/L乙酸铵（pH=3.0～4.0），采用梯度洗脱条件。
3.质谱条件：
采用电喷雾电离（IonSprary）-阳离子模式（ESI ）进行MRM方式检测，碰撞能量（CE）为35.0V。喷射电压（SI）5KV，毛细管温度（CT）350℃。
二、结果与讨论
（一）仪器条件选择
液相色谱条件选择：适当改变液相流动相的分配比，使待测物适当分离，可以提高检测的灵敏度和准确度。经实验测得，当加大甲醇的比例，待测物出峰的时间会提前，加大缓冲溶液的比例时，待测物的出峰时间会拖后。多次反复实验最终的梯度条件见表1。
根据质谱结果图，结合文献确定395/324为定量碎片离子峰。
（二）标准曲线的制备
分别取士的宁、马钱子碱标准品，分别配制成0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/mL浓度，均添加浓度5.0 g/mL的SKF525A作为内标，以待测物与内标物峰面积比为纵坐标，以添加浓度为横坐标，所得线性回归方程以及线性相关系数见表3。
取空白血5份，添加士的宁、马钱子碱0.001 g/mL，按照本文所述方法测定，以该测值信噪比3倍计，得出士的宁，马钱子碱药物血中检出限分别是1.0ng/mL，0.8 ng/mL。
（四）提取率
取1.0mL尿分别添加2种生物碱0.1 g，1.0 g，10.0 g按照本文所述方法进行提取，使用LC-MS/MS检测，所得2种药物提取率见表4。
（五）方法准确度与回收率
1.工作曲线的绘制：
取5份空白尿（血）检材各1mL，分别加入0.1，0.5，1.0，5.0，10 .0 g的2种生物碱标准品，添加配置成一系列浓度。按照本文所述方法前处理后，在5份尿（血）检材中分别添加内标标准品5.0 g，浓缩后取3.0 L进样，以待测物与内标物峰面积比为纵坐标，以添加浓度为横坐标绘制2种生物碱的工作曲线线性回归方程及相关系数。
取1.0mL空白尿（血）3份，各添加2种生物碱2.0 g，按照本文方法前处理后，添加内标标准品5.0 g，浓缩后取3.0 L进样。根据工作曲线得到2种生物碱的准确度。
关键词 固相萃取 高效液相色谱-电喷雾串联质谱 生物碱 士的宁 马钱子碱
作者简介：江卓、李婧，安徽省公安厅物证鉴定中心；苏昀，宣城市公安局物证鉴定中心。
中图分类号：D918 文献标识码：A DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2016.11.134
士的宁和马钱子碱是常见的生物碱，士的宁（strychnine）又称番木鳖碱，与马钱子碱（brucine）共存于马前属的许多植物中。
士的宁是一种中枢兴奋剂，医疗上常用作芭比胺类药物中毒解毒剂，在民间常用来毒鼠和禽兽。马钱子碱主要用于化学试剂，医疗上用作治疗中风引起的神经麻痹症及作为健胃药。本文采用血、尿两种生物检材，使用离子交换固相萃取结合液相色谱串联质谱联用作为检测手段，分别考查士的宁和马钱子碱的提取率，得到了较为满意的结果。
一、材料与方法
（一）仪器、试剂与材料
LXQ液相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）。
减压抽滤真空泵 AP-01P型（天津奥特赛恩仪器有限公司生产）。
低速离心机80-2型（上海手术器械厂生产）。
电热恒温水浴锅LSY型（北京市医疗设备厂生产）。
士的宁，马钱子碱，SKF525A标准品（公安部物证鉴定中心），配置成1.0mg/mL的储备液于冰箱保存。
新鲜全血浆（购于哈尔滨市呼兰区供血站），尿（正常成人）。
甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司生产）。
碳酸铵，乙酸铵，甲酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，浓氨水，浓盐酸均为分析纯。
OASISMCX 3cc（60mg）固相萃取柱，购至美国Waters公司。
（二）方法
1.样品前处理：
使用3.0mL甲醇，3.0mL去离子水依次过柱，再用3.0mL pH 5.0缓冲溶液过柱，使液体匀速通过小柱。待柱子平衡后，取1.0mL 血（尿）添加2.0mLpH5.0缓冲溶液后上柱，控制流速为1.0mL/min。然后用1.0mL 0.1mol/mL盐酸溶液过柱后，再用2.0mL去离子水淋洗杂质，挤干小柱填充物。再用4.0mL甲醇：氨水（90∶ 10）洗脱，控制流速为1.0mL/min，待小柱内液体流至近干，加压挤干小柱填充物。收集洗脱液，添加10.0 L 100.0 g/mLSKF525A。放置于70℃水浴中挥至近干，浓缩后用甲醇定容至1.0mL。0.45 m滤膜过滤后，取3.0 L注入LC-MS/MS，根据内标标准曲线法定量检测。
2.色谱条件液相色谱条件：
液相柱Thermo公司 HyPuRiTY C18 ODS 2.1mm€？50mm Column.流速0.200ml/min，采集时间控制15min，进样3.0 L。流动相：A：甲醇，B：5mmol/L乙酸铵（pH=3.0～4.0），采用梯度洗脱条件。
3.质谱条件：
采用电喷雾电离（IonSprary）-阳离子模式（ESI ）进行MRM方式检测，碰撞能量（CE）为35.0V。喷射电压（SI）5KV，毛细管温度（CT）350℃。
二、结果与讨论
（一）仪器条件选择
液相色谱条件选择：适当改变液相流动相的分配比，使待测物适当分离，可以提高检测的灵敏度和准确度。经实验测得，当加大甲醇的比例，待测物出峰的时间会提前，加大缓冲溶液的比例时，待测物的出峰时间会拖后。多次反复实验最终的梯度条件见表1。
根据质谱结果图，结合文献确定395/324为定量碎片离子峰。
（二）标准曲线的制备
分别取士的宁、马钱子碱标准品，分别配制成0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/mL浓度，均添加浓度5.0 g/mL的SKF525A作为内标，以待测物与内标物峰面积比为纵坐标，以添加浓度为横坐标，所得线性回归方程以及线性相关系数见表3。
取空白血5份，添加士的宁、马钱子碱0.001 g/mL，按照本文所述方法测定，以该测值信噪比3倍计，得出士的宁，马钱子碱药物血中检出限分别是1.0ng/mL，0.8 ng/mL。
（四）提取率
取1.0mL尿分别添加2种生物碱0.1 g，1.0 g，10.0 g按照本文所述方法进行提取，使用LC-MS/MS检测，所得2种药物提取率见表4。
（五）方法准确度与回收率
1.工作曲线的绘制：
取5份空白尿（血）检材各1mL，分别加入0.1，0.5，1.0，5.0，10 .0 g的2种生物碱标准品，添加配置成一系列浓度。按照本文所述方法前处理后，在5份尿（血）检材中分别添加内标标准品5.0 g，浓缩后取3.0 L进样，以待测物与内标物峰面积比为纵坐标，以添加浓度为横坐标绘制2种生物碱的工作曲线线性回归方程及相关系数。
取1.0mL空白尿（血）3份，各添加2种生物碱2.0 g，按照本文方法前处理后，添加内标标准品5.0 g，浓缩后取3.0 L进样。根据工作曲线得到2种生物碱的准确度。