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【摘 要】目的：研究吴茱萸次碱对重症急性胰腺炎应用疗效和机制。方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组和吴茱萸次碱组三组每组各10只，模型组和吴茱萸次碱组以5%牛磺胆酸钠经胆胰管逆行注入制模后，分别给予生理盐水和吴茱萸次碱处理。术后24小时采用用全自动生化分析仪检测各组血清淀粉酶（AMY）， 采用 ELISA检测白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-a）。结果：与假手术组比较，各组血清淀粉酶均升高（P<0.05）并且IL-6和TNF-a血浆表达水平明显升高（均P<0.01），吴茱萸次碱组血清淀粉酶、IL-6和TNF-a较模型组明显降低（P<0.05）。结论：吴茱萸次碱对大鼠SAP有治疗效果，其作用可能与降低IL-6和TNF-a炎症介质水平而抑制炎症反应有关。
【关键词】胰腺炎；吴茱萸次碱；白介素-6；肿瘤坏死因子
重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP）是消化系统常见的急腹症，其起病急，临床病情凶险，是一种死亡率非常高的疾病[1]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）作用研究者们对SAP发病机制提出了许多学说，如“中性粒细胞学说”“白细胞过度激活学说”等。SAP病变过程中，中性粒细胞在抗炎作用的同时，释放许多炎症介质如IL-6，TNF-a等，促炎因子IL-6和TNF-a介导SIRS和MODS的过程中具有相当重要的意义[2]。吴茱萸次碱是我国传统中药吴茱萸的主要活性成分，其药理学效应非常广泛，有抗炎、镇痛、强心和抗肿瘤活性等。本文通过观察SAP大鼠模型IL-6、TNF-a的水平探讨吴茱萸次碱对SAP治疗作用和相关机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性SD大鼠30只，体质量（200±10）g，由湖南斯莱克景达动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、模型组和吴茱萸次碱组各10只。假手术组：打开腹腔，显露出胰脏，但不注入牛磺胆酸钠；模型组：经胆胰管逆行注入 5% 牛黄胆酸钠；吴茱萸次碱组：造模后 1 h，给予吴茱萸次碱灌胃；各组分为2 个亚组，分别用于相关指标的检测。
1.2 实验药品与试剂仪器
吴茱萸次碱（中南大学药学院）；牛黃胆酸钠（美国 Sigma 公司）；TNF-a、IL-6放免试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）；酶标仪（美国 Molecular 公司）；Hitachi7600 型全自动生化仪（日本日立公司）；微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司）
1.3 方法
SD 大鼠术前自由饮水，禁食 12 h。使用 3%戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，然后在大鼠颈背部及腹部备皮。
1.3.1 大鼠静脉输液装置 大鼠呈仰卧位，做颈正中切口并分离出颈外静脉后在其上穿线备用，将硬膜外导管通过预先做好的颈背部皮肤小切口穿至颈部，切开颈外静脉，结扎远心端后将导管插入其近心端并结扎固定，然后将颈部切口缝合好。翻转大鼠并缝合颈背部切口，用一金属丝夹紧并固定导管。硬膜外导管待接输液泵。
1.3.2 大鼠 SAP 模型制作 铺无菌巾，做腹正中切口，沿十二指肠内侧找到片状分布的胰腺后，将胰腺及十二指肠均暴露于切口外，用无损伤动脉夹于临近肝门处夹闭胆胰管，磨钝 4.5 号注射器针头，于十二指肠乳头对侧肠壁穿刺至胆胰管，动脉夹固定针头，接微量注射泵注射 5% 牛黄胆酸钠（剂量：0.1 mL/100 g，速度：0.05 mL/min），注射后 5 min 松开动脉夹，退出针头，关闭腹腔。
1.3.3 给药方法与药物剂量 吴茱萸次碱固体分散剂（剂量：100 mg/kg，用蒸馏水溶解）于造模后 1 h，按 10 mL/kg 灌胃。
1.3.4 标本采集与指标检测 相关研究提示[3]，造模后 24 h 胰腺病变最为稳定，为得到有效可靠的结论，在造模后 24 h 麻醉并心脏采血 5 mL，常规分离血清并置 -80 ℃冰箱保存待测。⑴血清淀粉酶检测：用全自动生化分析仪测定大鼠血清淀粉酶活性。⑵血清TNF-a，IL-6含量检测采用放射免疫法检测。
1.4 统计学处理
采用 SPSS 14.0 统计软件包分析数据，所有数据正态分布参数用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和 q 检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清淀粉酶（AMY）含量
假手术组大鼠血清淀粉酶含量为（467.54±87.99）U/L，维持在低水平，其他各组大鼠血清淀粉酶含量均明显升高，且与假手术组间差异均有统计学意义（均P<0.05）。模型组大鼠血清淀粉酶活性升高最显著，为（4 399.51±2 014.70）U/L。吴茱萸次碱组大鼠血清淀粉酶含量为（3 075.70± 2 017.89）U/L，与模型组相比均有所下降，且差异有统计学意义（均P<0.05）（表1）。
2.2 各组大鼠血清IL-6，TNF-a含量
与假手术组比较，模型组、吴茱萸次碱组血清IL-6，TNF-a浓度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。吴茱萸次碱组血清IL-6，TNF-a低于模型组（P<0.01）。（表2）
3 讨论
重症急性胰腺炎是内科急腹症之一，其发病过程复杂，多因素参与其中。大多研究认为是胰酶在多种原因共同作用下被激活，导致消化自身胰腺组织并伴有多种炎症因子释放。目前重症急性胰腺炎的发病机制尚未完全阐明，研究者提出了许多急性胰腺炎发病机制的论，其中，“白细胞过度激活学说”“炎症因子级联瀑布效应学说”等在重症急性胰腺炎的整个病程中扮演着至关重要的作用[4]。胰腺组织微循环障碍，致使组织缺血缺氧、组织通透性增高及氧自由基的生成增加，并且激活单核-巨噬细胞系统释放大量炎性介质和细胞因子，如IL-6，TNF-a等[5]。粒细胞在炎症介质和细胞因子的作用下活化并向病灶趋化，吞噬坏死组织后由溶酶体消化降解。由于粒细胞过度激活，致使大量炎症介质和溶酶体向细胞核组织间质释放加重胰腺损伤[6]。过度的炎症介质和细胞因子又可引起“瀑布样”级联效应，最终引起多器官功能障碍综合症（MODS）[7]。 吴茱萸临床应用价值广泛，作为传统中药用于治疗高血压、头痛、产后出血、痢疾、闭经等疾病[8]。吴莱萸的主要有效成分吴莱萸次碱，同样具有广泛的药理学作用，大量研究证明其在心脏、胃粘膜的保护作用与抗炎、稳定溶酶体膜有关[9，10，11]。本实验证实，造模后24h大鼠中促炎症细胞因子中IL-6和TNF-a明显升高，同时大量研究报道，炎症因子IL-6和TNF-a相互作用推进炎症的进程[12]。这可能触发炎症的"瀑布样级联反应”，从而加重炎症反应甚至最终导致SIRS和MODS。而吴茱萸次碱能明显降低促炎性细胞因子IL-6和TNF-a浓度水平，
本实验在建立SAP大鼠模型的基础上，研究吴茱萸次碱对SAP大鼠的疗效和作用机制。吴茱萸次碱对胰腺的保护作用通过降低促炎因子水平来控制大鼠的炎症反应，表明吴茱萸次碱的胰腺保护作用与降低促炎因子有重要关系。因此，本实验为吴茱萸次碱的推广使用或者与其他药物共同作用治疗SAP提供一定的理论支持，对吴茱萸次碱的作用机制的研究提供实验基础。
参考文献：
[1]杨雯.急性胰腺炎全身炎症反应中核因子κB的关系及作用.哈尔滨医药，2010，30（5）：53-55.
[2]张明钧，袁耀宗.肠壁穿刺逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠重症急性胰腺炎造模.上海交通大学学报（医学版）2006；19：5720-5728.
[3]Wang L，Hu CP， Deng PY’ et al. The protective effects of rutaecarpine on gastricmucosa injury in rats. Planta Med. 2005； 71（5）： 416-419.
[4]李永渝.重症急性胰腺炎發病机制研究进展.中华外科杂志. 2009； 47 （19）：1478-1480.
[5]Talukdar R， Swaroop Vege S. Early management of severe acute pancreatitis[J]. Curr Gastroenterol Rep， 2011， 13（2）：123-130.
[6]张青顺，孙洪伟，朱椰凡，等.重症急性胰腺炎区域动脉灌注药物序贯组合方案的研究 [J]. 中国普通外科杂志 ， 2012， 21（3）：249-252.
[7]贾文焯，孙建华.磷脂酰肌醇 3-激酶γ对急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响.中华胰腺病杂志.2011；11（6）：417-419.
[8]Halangk W，Lerch MM，Brandt-Nedelev B， et a1.Role of cathepsin B in intraeellular trypsinogen activation and the on set of acute pancreatitis.J Clin Invest， 2000，106： 773 -781.
[9]Wang GJ，Shan J，Pang PK， et al. The vasorelaxing action of rutaecarpine；Direct paradoxical effects on intracellular calcium concentration of vascular smooth muscle and endothelial cells. J Pharmacol Exp Then 1996； 276（3）： 1016-1021.
[10]Hu CP，Xiao L，Deng HW， et al. The cardioprotection of rutaecarpine is mediated by endogenous calcitonin related-gene peptide throu^ activation of vanilloid receptors in guinea-pig hearts. Planta Med. 2002； 68（8）； 705-709.
[11]Brain SD，Grant AD： Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiol Rev 2004； 84（3）： 903-934.
[12]Vollmar B，Menger MD. Microcirculatory dysfunction in acute pancreatitis. A new concept of pathogenesis involving vasomotion-associated arteriolar constriction and dilation. Pancreatology， 2003； 3（3）： 181-190.
【关键词】胰腺炎；吴茱萸次碱；白介素-6；肿瘤坏死因子
重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP）是消化系统常见的急腹症，其起病急，临床病情凶险，是一种死亡率非常高的疾病[1]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）作用研究者们对SAP发病机制提出了许多学说，如“中性粒细胞学说”“白细胞过度激活学说”等。SAP病变过程中，中性粒细胞在抗炎作用的同时，释放许多炎症介质如IL-6，TNF-a等，促炎因子IL-6和TNF-a介导SIRS和MODS的过程中具有相当重要的意义[2]。吴茱萸次碱是我国传统中药吴茱萸的主要活性成分，其药理学效应非常广泛，有抗炎、镇痛、强心和抗肿瘤活性等。本文通过观察SAP大鼠模型IL-6、TNF-a的水平探讨吴茱萸次碱对SAP治疗作用和相关机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性SD大鼠30只，体质量（200±10）g，由湖南斯莱克景达动物中心提供。将大鼠随机分为假手术组、模型组和吴茱萸次碱组各10只。假手术组：打开腹腔，显露出胰脏，但不注入牛磺胆酸钠；模型组：经胆胰管逆行注入 5% 牛黄胆酸钠；吴茱萸次碱组：造模后 1 h，给予吴茱萸次碱灌胃；各组分为2 个亚组，分别用于相关指标的检测。
1.2 实验药品与试剂仪器
吴茱萸次碱（中南大学药学院）；牛黃胆酸钠（美国 Sigma 公司）；TNF-a、IL-6放免试剂盒（北京东亚免疫技术研究所）；酶标仪（美国 Molecular 公司）；Hitachi7600 型全自动生化仪（日本日立公司）；微量注射泵（深圳瑞沃德生命科技有限公司）
1.3 方法
SD 大鼠术前自由饮水，禁食 12 h。使用 3%戊巴比妥钠 40 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，然后在大鼠颈背部及腹部备皮。
1.3.1 大鼠静脉输液装置 大鼠呈仰卧位，做颈正中切口并分离出颈外静脉后在其上穿线备用，将硬膜外导管通过预先做好的颈背部皮肤小切口穿至颈部，切开颈外静脉，结扎远心端后将导管插入其近心端并结扎固定，然后将颈部切口缝合好。翻转大鼠并缝合颈背部切口，用一金属丝夹紧并固定导管。硬膜外导管待接输液泵。
1.3.2 大鼠 SAP 模型制作 铺无菌巾，做腹正中切口，沿十二指肠内侧找到片状分布的胰腺后，将胰腺及十二指肠均暴露于切口外，用无损伤动脉夹于临近肝门处夹闭胆胰管，磨钝 4.5 号注射器针头，于十二指肠乳头对侧肠壁穿刺至胆胰管，动脉夹固定针头，接微量注射泵注射 5% 牛黄胆酸钠（剂量：0.1 mL/100 g，速度：0.05 mL/min），注射后 5 min 松开动脉夹，退出针头，关闭腹腔。
1.3.3 给药方法与药物剂量 吴茱萸次碱固体分散剂（剂量：100 mg/kg，用蒸馏水溶解）于造模后 1 h，按 10 mL/kg 灌胃。
1.3.4 标本采集与指标检测 相关研究提示[3]，造模后 24 h 胰腺病变最为稳定，为得到有效可靠的结论，在造模后 24 h 麻醉并心脏采血 5 mL，常规分离血清并置 -80 ℃冰箱保存待测。⑴血清淀粉酶检测：用全自动生化分析仪测定大鼠血清淀粉酶活性。⑵血清TNF-a，IL-6含量检测采用放射免疫法检测。
1.4 统计学处理
采用 SPSS 14.0 统计软件包分析数据，所有数据正态分布参数用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和 q 检验。P<0.05 认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清淀粉酶（AMY）含量
假手术组大鼠血清淀粉酶含量为（467.54±87.99）U/L，维持在低水平，其他各组大鼠血清淀粉酶含量均明显升高，且与假手术组间差异均有统计学意义（均P<0.05）。模型组大鼠血清淀粉酶活性升高最显著，为（4 399.51±2 014.70）U/L。吴茱萸次碱组大鼠血清淀粉酶含量为（3 075.70± 2 017.89）U/L，与模型组相比均有所下降，且差异有统计学意义（均P<0.05）（表1）。
2.2 各组大鼠血清IL-6，TNF-a含量
与假手术组比较，模型组、吴茱萸次碱组血清IL-6，TNF-a浓度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。吴茱萸次碱组血清IL-6，TNF-a低于模型组（P<0.01）。（表2）
3 讨论
重症急性胰腺炎是内科急腹症之一，其发病过程复杂，多因素参与其中。大多研究认为是胰酶在多种原因共同作用下被激活，导致消化自身胰腺组织并伴有多种炎症因子释放。目前重症急性胰腺炎的发病机制尚未完全阐明，研究者提出了许多急性胰腺炎发病机制的论，其中，“白细胞过度激活学说”“炎症因子级联瀑布效应学说”等在重症急性胰腺炎的整个病程中扮演着至关重要的作用[4]。胰腺组织微循环障碍，致使组织缺血缺氧、组织通透性增高及氧自由基的生成增加，并且激活单核-巨噬细胞系统释放大量炎性介质和细胞因子，如IL-6，TNF-a等[5]。粒细胞在炎症介质和细胞因子的作用下活化并向病灶趋化，吞噬坏死组织后由溶酶体消化降解。由于粒细胞过度激活，致使大量炎症介质和溶酶体向细胞核组织间质释放加重胰腺损伤[6]。过度的炎症介质和细胞因子又可引起“瀑布样”级联效应，最终引起多器官功能障碍综合症（MODS）[7]。 吴茱萸临床应用价值广泛，作为传统中药用于治疗高血压、头痛、产后出血、痢疾、闭经等疾病[8]。吴莱萸的主要有效成分吴莱萸次碱，同样具有广泛的药理学作用，大量研究证明其在心脏、胃粘膜的保护作用与抗炎、稳定溶酶体膜有关[9，10，11]。本实验证实，造模后24h大鼠中促炎症细胞因子中IL-6和TNF-a明显升高，同时大量研究报道，炎症因子IL-6和TNF-a相互作用推进炎症的进程[12]。这可能触发炎症的"瀑布样级联反应”，从而加重炎症反应甚至最终导致SIRS和MODS。而吴茱萸次碱能明显降低促炎性细胞因子IL-6和TNF-a浓度水平，
本实验在建立SAP大鼠模型的基础上，研究吴茱萸次碱对SAP大鼠的疗效和作用机制。吴茱萸次碱对胰腺的保护作用通过降低促炎因子水平来控制大鼠的炎症反应，表明吴茱萸次碱的胰腺保护作用与降低促炎因子有重要关系。因此，本实验为吴茱萸次碱的推广使用或者与其他药物共同作用治疗SAP提供一定的理论支持，对吴茱萸次碱的作用机制的研究提供实验基础。
参考文献：
[1]杨雯.急性胰腺炎全身炎症反应中核因子κB的关系及作用.哈尔滨医药，2010，30（5）：53-55.
[2]张明钧，袁耀宗.肠壁穿刺逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠重症急性胰腺炎造模.上海交通大学学报（医学版）2006；19：5720-5728.
[3]Wang L，Hu CP， Deng PY’ et al. The protective effects of rutaecarpine on gastricmucosa injury in rats. Planta Med. 2005； 71（5）： 416-419.
[4]李永渝.重症急性胰腺炎發病机制研究进展.中华外科杂志. 2009； 47 （19）：1478-1480.
[5]Talukdar R， Swaroop Vege S. Early management of severe acute pancreatitis[J]. Curr Gastroenterol Rep， 2011， 13（2）：123-130.
[6]张青顺，孙洪伟，朱椰凡，等.重症急性胰腺炎区域动脉灌注药物序贯组合方案的研究 [J]. 中国普通外科杂志 ， 2012， 21（3）：249-252.
[7]贾文焯，孙建华.磷脂酰肌醇 3-激酶γ对急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响.中华胰腺病杂志.2011；11（6）：417-419.
[8]Halangk W，Lerch MM，Brandt-Nedelev B， et a1.Role of cathepsin B in intraeellular trypsinogen activation and the on set of acute pancreatitis.J Clin Invest， 2000，106： 773 -781.
[9]Wang GJ，Shan J，Pang PK， et al. The vasorelaxing action of rutaecarpine；Direct paradoxical effects on intracellular calcium concentration of vascular smooth muscle and endothelial cells. J Pharmacol Exp Then 1996； 276（3）： 1016-1021.
[10]Hu CP，Xiao L，Deng HW， et al. The cardioprotection of rutaecarpine is mediated by endogenous calcitonin related-gene peptide throu^ activation of vanilloid receptors in guinea-pig hearts. Planta Med. 2002； 68（8）； 705-709.
[11]Brain SD，Grant AD： Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiol Rev 2004； 84（3）： 903-934.
[12]Vollmar B，Menger MD. Microcirculatory dysfunction in acute pancreatitis. A new concept of pathogenesis involving vasomotion-associated arteriolar constriction and dilation. Pancreatology， 2003； 3（3）： 181-190.