【摘 要】
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目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层通透性改变的效应分子,以寻找内皮细胞损伤修复的有效治疗靶点.方法 应用TNF-α刺激体外培养的HUVEC,观
【机 构】
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沈阳军区总医院全军心血管病研究所心内科,南京军区福州总医院心内科
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目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)单层通透性改变的效应分子,以寻找内皮细胞损伤修复的有效治疗靶点.方法 应用TNF-α刺激体外培养的HUVEC,观察HUVEC骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变.应用荧光免疫组织化学和Western blot方法检测TNF-α刺激前后细胞中RhoA和MAPK信号通路的改变.并通过添加特异性分子抑制剂Y27632和PD98059阻断RhoA和ERK表达,观察细胞F-actin及细胞单层通透性的改变.进一步应用持续活化型RhoA和主导抑制型RhoA逆转录病毒分别感染改变人HUVEC,改变细胞中RhoA的活化状态,观察TNF-α刺激前后细胞骨架蛋白及单层细胞通透性的变化.并确定RhoA与ERK的相互作用.结果 TNF-α刺激引起HUVEC中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强,呈现时间和剂量依赖性趋势.其中TNF-α(100 ng/ml)刺激2 h后细胞单层通透性最强,HRP-BSA渗漏最大浓度为40 ng/ml.同时,细胞中活化RhoA的表达明显增加.TNF-α刺激前后细胞中MAPK信号转导蛋白JNK、P38和ERK1/2总蛋白均无明显改变,但p-JNK、p-p38和p-ERK表达均显著增加.其中,应用Y27632抑制RhoA的活化或PD98059阻断p-ERK表达后,TNF-α刺激的HUVEC中F-actin重构现象消失,同时细胞单层通透性增加也受到明显抑制,HRP-BSA渗漏浓度从40 ng/ml下降至12.5 ng/ml(P
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