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摘要：【目的】明確供试微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的大田防治效果及其对甘蓝植株的促生作用，为甘蓝黑腐病的生物防治提供参考。【方法】通过室内盆栽灌根法测定4株生防木霉菌（GYXM-1p1、GYSW-3m1、KLSD-8m3和GYYC-15p2）对甘蓝植株的促生作用;采用田间灌根、根部穴施和叶面喷施等方法评价4株生防木霉菌（GYXM-1p1、GYSW-3m1、KLSD-8m3和GYYC-15p2）和4种微生物菌剂（抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥、淡紫拟青霉微生物肥、沃丰康—复合微生物菌剂和沃丰康—克线散粉剂）对甘蓝黑腐病的田间防治效果及其对甘蓝植株的促生作用。【结果】盆栽促生试验结果表明，4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝的促生作用最明显，处理后甘蓝植株的株高、根长、茎叶鲜重和干重、根鲜重和干重、植株总鲜重和总干重均显著高于清水对照（P<0.05），其中植株总鲜重和总干重分别较清水对照增加417.60%和762.69%。大田促生试验结果表明，4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝叶球的促生作用最明显，叶球鲜重为1758.89 g/个，较清水对照增幅为23.19%;4种微生物菌剂中沃丰康—克线散粉剂对叶球的促生作用最明显，叶球鲜重为1882.22 g/个，增幅为31.83%，其次是抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥，叶球鲜重为1818.89 g/个，增幅为27.39%。大田防效试验结果表明，4株生防木霉菌中GYYC-15p2菌株对甘蓝黑腐病的防治效果最佳，防效达79.16%，其次是GYXM-1p1菌株，防效为63.62%;沃丰康—复合微生物菌剂、淡紫拟青霉微生物肥、抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥和沃丰康—克线散粉剂对甘蓝黑腐病的防效分别为67.77%、67.77%、66.29%和57.41%，4者防效差异不显著（P>0.05）。【结论】生防木霉菌GYXM-1p1菌株可作为生防资源应用于甘蓝黑腐病防治，抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥可直接应用于大田甘蓝黑腐病的防治。
关键词： 甘蓝黑腐病;微生物菌剂;木霉菌;防效;促生作用
中图分类号：S436.35 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0761-07
Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for screening the highly effective biocontrol agents for controlling cabbage black rot， control effects of microbial preparations and biocontrol strains of Trichoderma on cabbage black rot in field and its growth-promoting effect on cabbage were researched. 【Method】The growth-promoting effects of the four biocontrol strains of Trichoderm（GYXM-1p1， GYSW-3m1， KLSD-8m3 and GYYC-15p2） on cabbage were tested by root irrigation in pot experiments. The growth-promoting and control effects of black rot of the four biocontrol strains of Trichoderma（GYXM-1p1， GYSW-3m1， KLSD-8m3 and GYYC-15p2） and the four microbial preparations （Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer， Paecilomyces lilacinus microbial fertilizer， Wofengkang-compound microbial preparation and Wofengkang-Kexiansan powder） on cabbage were tested by root irrigation， applying in holes near root and foliage spraying in the field. 【Result】Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of pot pro-growth experiments showed that strain GYXM-1p1 treatment was the most useful on growth promotion， the plant height， root length， fresh and dry weight of foliage and stem， fresh and dry weight of root， total fresh weight and total dry weight of plant were significantly higher than clear water control treatment（P<0.05）， with the plant total fresh weight and total dry weight increased by 417.60% and 762.69% compared with control respectively. Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of field pro-growth experiments showed that GYXM-1p1 treatment had the highest growth-promoting effect on cabbage bulb， the bulb fresh weight was 1758.89 g/bulb， and the increase was 23.19% compared with control. Among the four microbial preparations， Wofengkang-Kexiansan powder treatment had the highest growth-promoting effect on cabbage bulb， the bulb fresh weight was 1882.22 g/bulb and increased by 31.83%， followed by Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer treatment， the bulb fresh weight was 1818.89 g/bulb and increased by 27.39%. Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of field effect tests showed that GYYC-15p2 treatment had the best control effect， the control effect was up to 79.16%， followed by GYXM-1p1 treatment， the control effect was 63.62%. The control effects of Wofengkang-compound microbial preparation， P. lilacinus microbial fertilizer， Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer and Wofengkang-Kexiansan powder treatments were 67.77%， 67.77%， 66.29% and 57.41%， respectively， and the differences were not significant（P>0.05）. 【Conclusion】The present study indicates that strain GYXM-1p1 can be used as an important biocontrol resource for the prevention and control of cabbage black rot. Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer can be directly used to control ca-bbage black rot. Key words： cabbage black rot; microbial preparations; Trichoderma; control effect; growth promoting
0 引言
【研究意义】甘蓝（Brassica oleracea L.）是一种重要的十字花科蔬菜，在全世界普遍种植，我国是目前甘蓝种植面积最大的国家，占世界总种植面积的47%，2014年全国甘蓝种植面积达43万ha，总产量903万t（戴忠良等，2018;Beeresh and Shripad，2018）。甘蓝黑腐病是由黄单胞杆菌属（Xanthomonas cam-pestris pv. campestris，Xcc）浸染引起的一种甘蓝毁灭性病害（Liu et al.，2016），主要危害甘蓝外围叶片，幼苗和成株均可受害，幼苗染病，子叶呈水浸状，逐渐枯死，成株发病多从叶缘开始，形成V字形黄褐色病斑，边缘有黄色晕环，病斑扩大后常出现叶斑和叶脉变黑，直接影响植株光合作用，也能侵害叶球，叶球发病时病斑淡黑色，局部的叶脉变紫黑色并逐渐扩大，但不会软化腐败，该病在田间发病严重时可造成植株大量死亡，直接影响生产效益（陈茂春，2015;梁元凯等，2016）。因此，筛选防控甘蓝黑腐病的高效措施对促进甘蓝产业绿色健康发展和提高农民收入均具有重要意义。【前人研究进展】国内外主要是通过栽培管理、物理防治、化学防治和生物防治等手段防治甘蓝黑腐病，目前生物防治已成为最具吸引力和最绿色环保的防治措施。已报道用于防治甘蓝黑腐病的生防微生物主要有荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、类芽孢杆菌（Paenibacillus spp.）和酵母菌（Yeast）等。Assis等（1999）從20株酵母菌株中筛选出3株（LR32、LR42和LR19）菌株，可使甘蓝黑腐病发生率分别减少72%、75%和79%。Wulff等（2002a，2002b）研究发现9株（29C、69、8、17A、101、103、15、17C和71）解淀粉芽孢杆菌能使苗期甘蓝黑腐病发生率减少60%以上，同时发现枯草芽孢杆菌BB菌株能抑制3株甘蓝黑腐病病原菌黄单胞杆菌生长。Mishra和Arora（2012）发现荧光假单胞菌菌株To7能产生抗生素2，4-diacetylphloroglucinol抑制甘蓝黑腐病病原菌黄单胞杆菌生长。Ghazalibiglar等（2016）从24株类芽孢杆菌中筛选得到3株（P6、P10和P16）菌株，在室内盆栽试验中能减少甘蓝子叶和真叶的黑腐症状。Liu等（2016）通过混合施用5种植物根际促生芽孢杆菌（AP213、AP218、AP219、AP295和AP305），发现在温室和大田试验中均能明显降低甘蓝黑腐病的发生率。【本研究切入点】尽管前人在甘蓝黑腐病生物防治方面开展了一些研究工作，但主要是以细菌（芽孢杆菌）抑制细菌（黄单胞杆菌），目前仍缺少可替代化学农药的高效微生物菌剂。【拟解决的关键问题】以4种含有不同有效微生物活性成分的微生物菌剂（有效活性成分包括淡紫拟青霉、粉红粘帚霉、木霉菌、枯草芽孢杆菌和内生芽孢杆菌）和4株生防木霉菌（自筛）为研究靶标，通过室内盆栽和大田试验测定分析4种微生物菌剂和4株生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治效果及其对甘蓝植株的促生作用，以期筛选出拮抗活性强、防治效果好的微生物菌剂直接应用于大田甘蓝黑腐病防治，同时对4株生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治促生效果进行评价，为甘蓝黑腐病的生物防治提供优良菌种资源。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试甘蓝品种：中甘21号，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。供试生防木霉菌：GYXM-1p1、KLSD-8m3、GYSW-3m1和GYYC-15p2菌株，由贵州省农业科学院植物保护研究所生防实验室前期分离获得。供试微生物菌剂：沃丰康—克线散粉剂（2亿活菌量/g），微生物活性成分为淡紫拟青霉，北京启高生物科技有限公司产品;沃丰康—复合微生物菌剂（10亿活菌量/g），微生物活性成分为枯草芽孢杆菌和粉红粘帚霉，北京启高生物科技有限公司产品;淡紫拟青霉微生物肥（20亿活菌量/mL），微生物活性成分为淡紫拟青霉，北京启高生物科技有限公司产品;抗重茬微生态制剂（5亿活菌量/g），微生物活性成分为枯草芽孢杆菌和木霉菌，中农绿康（北京）生物技术有限公司产品;绿康威（20 g/袋）微生物肥，微生物活性成分为内生芽孢杆菌，中农绿康（北京）生物技术有限公司产品。供试对照化学药剂：75%百菌清可湿性粉剂，东菀市瑞德丰生物科技有限公司产品;30%甲霜噁霉灵水剂，河南远见农业科技有限公司产品。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 生防木霉菌对甘蓝的盆栽促生作用试验 将甘蓝种子催芽后播种于人工气候箱，待小苗长出3～4片子叶时移栽至直径为10 cm的塑料钵内，塑料钵内营养土经灭菌处理，用灭菌水浇透，移栽后遮光24 h，之后将塑料钵放入25 ℃、12 h光照/12 h黑暗的温室培养一周后待用。试验共设5个处理，分别以KLSD-8m3、GYYC-15p2、GYSW-3m1和GYXM-1p1分生孢子悬浮液灌根接种（3 mL/株，浓度为106个/mL），以清水为对照。每处理4个重复，共施菌2次（第1次施菌20 d后施第2次菌）。
于第1次施菌后45 d，小心将甘蓝植株整株完整挖出，测量其株高和根长，并称量鲜重（茎叶鲜重、根鲜重和总鲜重），再将植株置于45 ℃烘箱中烘干72 h，称量其干重（茎叶干重、根干重和总干重）（李德全等，2016），统计和评估生防菌对甘蓝植株的促生效果，并计算增幅。
1. 2. 2 微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的田间防效及其促生作用试验 试验在贵州省贵阳市息烽县石洞乡高峰村甘蓝种植基地大田进行，于甘蓝苗移栽2周后施第1次药，30 d后施第2次药，共设11个处理：处理（1）～处理（4），分别以KLSD-8m3、GYYC-15p2、GYSW-3m1和GYXM-1分生孢子液灌根（20 mL/株，分生孢子液浓度106个/mL）;处理（5）沃丰康—复合微生物菌剂穴施（2.5 g/株）;处理（6）沃丰康—克线散粉剂穴施（1.0 g/株）;处理（7）淡紫拟青霉灌根（稀释50倍液，25 mL/株）;处理（8）抗重茬微生态制剂穴施（1.0 g/株）;处理（9）75%百菌清可湿性粉剂稀释喷雾（稀释1000倍液，6.3 g/3小区）作为农药对照;处理（10）30%甲霜噁霉灵稀释喷雾（稀释800倍液，10.0 g/3小区）作为农药对照;处理（11）喷施清水作为空白对照。每处理3个重复（小区），每重复（小区）6.5 m2，每重复（小区）40株甘蓝。 于甘蓝收获期小心将甘蓝植株整株完整挖出并进行调查，方法同1.2.1，测量其株高和根长，称量其叶球鲜重和根鲜重，每处理3重复（小区），每重复（小区）15株。
于甘蓝收获期，对甘蓝叶片黑腐病发病情况进行分级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果，每重复（小区）10株（每株叶片全部调查），3个重复（小区）。参照《农药田间药效试验准则（三）》（姜辉等，2004）制定分级标准。分级标准：0级，叶片无病斑;1级，叶片病斑占整张叶片面积的5%以下;3级，叶片病斑占整张叶片面积的6%～10%;5级，叶片病斑面积占整张叶片面积的11%～25%;7级，叶片病斑面积占整张叶片面积的26%～50%;9级，叶片病斑面积占整张叶片面积的50%以上。
1. 3 统计分析
运用DPS 7.05通过最小显著差异法（LSD）比较不同处理间的差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 生防木霉菌对甘蓝的盆栽促生作用
于第1次施菌后45 d调查生防木霉菌对盆栽甘蓝的促生效果，结果（表1和图1-A）显示，4株生防木霉菌对甘蓝植株均有一定的促生作用，其中，GYXM-1p1菌株对甘蓝苗的促生作用最明显，处理后甘蓝植株的株高、根长、茎叶鲜重和干重、根鲜重和干重、植株总鲜重和总干重均显著高于对照（P<0.05，下同），植株总鲜重和总干重分别较对照增加417.60%和762.69%，且对根生长的促进作用更明显，植株根鲜重和根干重分别较清水对照增加865.29%和744.79%;其次是KLSD-8m3和GYSW-3m1菌株，处理后植株的株高、根长、茎叶鲜重和干重、根鲜重和干重、植株总鲜重和总干重均显著高于清水对照;GYYC-15p2菌株的促生作用偏小，与清水对照差异不显著（P>0.05，下同）。
2. 2 微生物菌剂和生防木霉菌对大田甘蓝的促生作用
调查结果（表2、图1-B和图1-C）显示，4株生防木霉菌和4种微生物菌剂对大田甘蓝均有一定的促生作用。经4株生防木霉菌处理的甘蓝株高均高于清水对照，但差异不显著;4种微生物菌剂中以淡紫拟青霉微生物肥处理的甘蓝株高最高，达39.52 cm，且显著高于清水对照和30%甲霜噁霉灵水剂农药对照，与清水对照相比株高增幅为6.80%，其他处理与清水对照和农药对照均无显著差异，其次是沃丰康—复合微生物菌剂和抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理，株高增幅分别为5.92%和5.89%。生防木霉菌、微生物菌剂和农药对照处理的甘蓝叶球鲜重均显著高于清水对照，生防木霉菌和微生物菌剂处理的甘蓝叶球鲜重也明显高于农药对照，4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝叶球鲜重的促生作用最明显，叶球鲜重为1758.89 g/个，叶球鲜重增幅为23.19%;4种微生物菌剂中沃丰康—克线散粉剂对甘蓝叶球的促生作用最显著，叶球鲜重达1882.22 g/个，叶球鲜重增幅为31.83%，其次是抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥，叶球鲜重为1818.89 g/个，增幅为27.39%。4株生防木霉菌中GYSW-3m1菌株对甘蓝根长的促生作用最显著，根长为29.60 cm，根长增幅为22.72%，显著高于其他处理;4种微生物菌剂中淡紫拟青霉微生物肥和抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理的甘蓝根长分别为28.70和28.62 cm，根长增幅分别为18.99%和18.66%。4株生防木霉菌中GYSW-3m1菌株对甘蓝根鲜重的促生作用最明显，根鲜重为34.52 g/株，根鲜重增幅为23.11%，其次是GYXM-1p1菌株，根鲜重为31.36 g/株，根鲜重增幅为11.84%;4种微生物菌剂中抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理对甘蓝根鲜重的促生作用最明显，根鲜重为36.54 g/株，根鲜重增幅为30.31%，显著高于清水对照和75%百菌清可湿性粉剂农药对照，其次是淡紫拟青霉微生物肥和沃丰康—克线散粉剂处理，甘蓝根鲜重分别为35.36和34.40 g/株，根鲜重增幅分别为26.11%和22.68%。
2. 3 微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的田间防效
调查结果（表3）显示，所有处理对甘蓝黑腐病均有一定防治效果。4株生防木霉菌中GYYC-15p2菌株對甘蓝黑腐病的防治效果最佳，防效达79.16%，与75%百菌清可湿性粉剂农药对照的防效差异不显著;其次是GYXM-1p1菌株，防效为63.62%。沃丰康—复合微生物菌剂、淡紫拟青霉微生物肥、抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥和沃丰康—克线散粉剂对甘蓝黑腐病的防效分别为67.77%、67.77%、66.29%和57.41%，四者间的防效差异不显著。30%甲霜噁霉灵水剂农药对照对甘蓝黑腐病的防治效果最差，防效仅为36.98%，显著低于GYYC-15p2菌株和75%百菌清可湿性粉剂处理，与其他处理差异不显著。
3 讨论
本研究应用含有不同微生物活性成分的微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治效果及其对甘蓝植株的促生作用进行探讨分析，结果表明，不同有效微生物活性成分对甘蓝黑腐病的防治效果及对甘蓝植株的促生增产均有一定作用。4种微生物菌剂中抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥复配处理，有效微生物活性成分包括芽孢杆菌、木霉菌和有益内生芽孢杆菌，其对甘蓝黑腐病的防治效果和甘蓝植株促生作用均较好，防效可达66.29%，叶球鲜重增幅为27.39%，可直接应用于甘蓝黑腐病的防治。本研究结果表明，将芽孢杆菌+木霉菌+有益内生芽孢杆菌复配施用，能充分发挥芽孢杆菌的拮抗作用和木霉菌的拮抗促生作用，实现不同生防机制同时发挥作用，避免单一使用生防菌导致病原微生物产生抗性的问题。4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝黑腐病的防治效果和甘蓝植株促生作用也较好，对甘蓝黑腐病的防效为63.62%，能使植株总鲜重和总干重分别较清水对照增加417.60%和762.69%。在前人的研究报道中，主要以芽孢杆菌防治甘蓝黑腐病，应用真菌特别是生防木霉菌防治甘蓝黑腐病的研究鲜见报道。木霉菌（Trichoderma spp.）是一类优秀的生防有益菌，不仅对植物病原真菌具有广谱拮抗性，还具有促进植物生长的作用（Altomare et al.，1999;张丽荣等，2018）。木霉菌作用的靶标微生物多为真菌，但由于木霉菌的竞争能力较强，且其产生的某些次级代谢产物常具有抗细菌活性，梁小蕊（2016）报道从桔绿木霉菌cf27发酵粗提物中分离得到的二萜化合物（TC2）对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）具有明显抑制效果。本研究结果表明，木霉菌能通过某些生防作用机制抑制细菌病原菌生长，其中GYXM-1p1菌株可作为一种重要的生防资源应用于甘蓝黑腐病防治，具有一定的开发潜力。 参考已有研究报道（潘青仙和金灵占，2004;黄美玲，2012）并结合生产实际，本研究中微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝大田促生作用的影响主要表现在增加单球鲜重（净菜重）上，在2017年的结球甘蓝价格水平下各微生物菌剂和生防木霉菌施用处理后甘蓝的增产增收效果显著。2017年甘蓝市场平均批发价为0.6元/kg（当地收购价格），每公顷约40500株（当地种植密度）（周文美，2016），与当地农户甘蓝种植情况相比（平均单球重1700 g），沃丰康—克线散粉剂、抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥、沃丰康—复合微生物菌剂和淡紫拟青霉微生物肥处理后分别增收4427.95、2889.03、2106.08和1295.92元/ha，GYXM-1p1菌株处理能增收1431.03元/ha;此外，甘蓝的市场价格还取决于其商品性，甘蓝黑腐病的发病程度严重影响甘蓝的商品性。因此，本研究主要是综合微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝的增产促生作用和对甘蓝黑腐病的防治作用进行菌剂筛选。
4 结论
生防木霉菌GYXM-1p1菌株具有拮抗和促生双重作用，可作为生防资源应用于甘蓝黑腐病防治，具有一定的开发潜力;抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥复配处理能充分发挥不同微生物活性成分的拮抗促生作用，实现不同生防机制同时发挥作用，可直接应用于大田甘蓝黑腐病的防治。
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（責任编辑 麻小燕）
关键词： 甘蓝黑腐病;微生物菌剂;木霉菌;防效;促生作用
中图分类号：S436.35 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）04-0761-07
Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for screening the highly effective biocontrol agents for controlling cabbage black rot， control effects of microbial preparations and biocontrol strains of Trichoderma on cabbage black rot in field and its growth-promoting effect on cabbage were researched. 【Method】The growth-promoting effects of the four biocontrol strains of Trichoderm（GYXM-1p1， GYSW-3m1， KLSD-8m3 and GYYC-15p2） on cabbage were tested by root irrigation in pot experiments. The growth-promoting and control effects of black rot of the four biocontrol strains of Trichoderma（GYXM-1p1， GYSW-3m1， KLSD-8m3 and GYYC-15p2） and the four microbial preparations （Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer， Paecilomyces lilacinus microbial fertilizer， Wofengkang-compound microbial preparation and Wofengkang-Kexiansan powder） on cabbage were tested by root irrigation， applying in holes near root and foliage spraying in the field. 【Result】Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of pot pro-growth experiments showed that strain GYXM-1p1 treatment was the most useful on growth promotion， the plant height， root length， fresh and dry weight of foliage and stem， fresh and dry weight of root， total fresh weight and total dry weight of plant were significantly higher than clear water control treatment（P<0.05）， with the plant total fresh weight and total dry weight increased by 417.60% and 762.69% compared with control respectively. Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of field pro-growth experiments showed that GYXM-1p1 treatment had the highest growth-promoting effect on cabbage bulb， the bulb fresh weight was 1758.89 g/bulb， and the increase was 23.19% compared with control. Among the four microbial preparations， Wofengkang-Kexiansan powder treatment had the highest growth-promoting effect on cabbage bulb， the bulb fresh weight was 1882.22 g/bulb and increased by 31.83%， followed by Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer treatment， the bulb fresh weight was 1818.89 g/bulb and increased by 27.39%. Among the four biocontrol strains of Trichoderma， the results of field effect tests showed that GYYC-15p2 treatment had the best control effect， the control effect was up to 79.16%， followed by GYXM-1p1 treatment， the control effect was 63.62%. The control effects of Wofengkang-compound microbial preparation， P. lilacinus microbial fertilizer， Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer and Wofengkang-Kexiansan powder treatments were 67.77%， 67.77%， 66.29% and 57.41%， respectively， and the differences were not significant（P>0.05）. 【Conclusion】The present study indicates that strain GYXM-1p1 can be used as an important biocontrol resource for the prevention and control of cabbage black rot. Kangchongcha probiotics+Lükangwei microbial fertilizer can be directly used to control ca-bbage black rot. Key words： cabbage black rot; microbial preparations; Trichoderma; control effect; growth promoting
0 引言
【研究意义】甘蓝（Brassica oleracea L.）是一种重要的十字花科蔬菜，在全世界普遍种植，我国是目前甘蓝种植面积最大的国家，占世界总种植面积的47%，2014年全国甘蓝种植面积达43万ha，总产量903万t（戴忠良等，2018;Beeresh and Shripad，2018）。甘蓝黑腐病是由黄单胞杆菌属（Xanthomonas cam-pestris pv. campestris，Xcc）浸染引起的一种甘蓝毁灭性病害（Liu et al.，2016），主要危害甘蓝外围叶片，幼苗和成株均可受害，幼苗染病，子叶呈水浸状，逐渐枯死，成株发病多从叶缘开始，形成V字形黄褐色病斑，边缘有黄色晕环，病斑扩大后常出现叶斑和叶脉变黑，直接影响植株光合作用，也能侵害叶球，叶球发病时病斑淡黑色，局部的叶脉变紫黑色并逐渐扩大，但不会软化腐败，该病在田间发病严重时可造成植株大量死亡，直接影响生产效益（陈茂春，2015;梁元凯等，2016）。因此，筛选防控甘蓝黑腐病的高效措施对促进甘蓝产业绿色健康发展和提高农民收入均具有重要意义。【前人研究进展】国内外主要是通过栽培管理、物理防治、化学防治和生物防治等手段防治甘蓝黑腐病，目前生物防治已成为最具吸引力和最绿色环保的防治措施。已报道用于防治甘蓝黑腐病的生防微生物主要有荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、类芽孢杆菌（Paenibacillus spp.）和酵母菌（Yeast）等。Assis等（1999）從20株酵母菌株中筛选出3株（LR32、LR42和LR19）菌株，可使甘蓝黑腐病发生率分别减少72%、75%和79%。Wulff等（2002a，2002b）研究发现9株（29C、69、8、17A、101、103、15、17C和71）解淀粉芽孢杆菌能使苗期甘蓝黑腐病发生率减少60%以上，同时发现枯草芽孢杆菌BB菌株能抑制3株甘蓝黑腐病病原菌黄单胞杆菌生长。Mishra和Arora（2012）发现荧光假单胞菌菌株To7能产生抗生素2，4-diacetylphloroglucinol抑制甘蓝黑腐病病原菌黄单胞杆菌生长。Ghazalibiglar等（2016）从24株类芽孢杆菌中筛选得到3株（P6、P10和P16）菌株，在室内盆栽试验中能减少甘蓝子叶和真叶的黑腐症状。Liu等（2016）通过混合施用5种植物根际促生芽孢杆菌（AP213、AP218、AP219、AP295和AP305），发现在温室和大田试验中均能明显降低甘蓝黑腐病的发生率。【本研究切入点】尽管前人在甘蓝黑腐病生物防治方面开展了一些研究工作，但主要是以细菌（芽孢杆菌）抑制细菌（黄单胞杆菌），目前仍缺少可替代化学农药的高效微生物菌剂。【拟解决的关键问题】以4种含有不同有效微生物活性成分的微生物菌剂（有效活性成分包括淡紫拟青霉、粉红粘帚霉、木霉菌、枯草芽孢杆菌和内生芽孢杆菌）和4株生防木霉菌（自筛）为研究靶标，通过室内盆栽和大田试验测定分析4种微生物菌剂和4株生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治效果及其对甘蓝植株的促生作用，以期筛选出拮抗活性强、防治效果好的微生物菌剂直接应用于大田甘蓝黑腐病防治，同时对4株生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治促生效果进行评价，为甘蓝黑腐病的生物防治提供优良菌种资源。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试甘蓝品种：中甘21号，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育。供试生防木霉菌：GYXM-1p1、KLSD-8m3、GYSW-3m1和GYYC-15p2菌株，由贵州省农业科学院植物保护研究所生防实验室前期分离获得。供试微生物菌剂：沃丰康—克线散粉剂（2亿活菌量/g），微生物活性成分为淡紫拟青霉，北京启高生物科技有限公司产品;沃丰康—复合微生物菌剂（10亿活菌量/g），微生物活性成分为枯草芽孢杆菌和粉红粘帚霉，北京启高生物科技有限公司产品;淡紫拟青霉微生物肥（20亿活菌量/mL），微生物活性成分为淡紫拟青霉，北京启高生物科技有限公司产品;抗重茬微生态制剂（5亿活菌量/g），微生物活性成分为枯草芽孢杆菌和木霉菌，中农绿康（北京）生物技术有限公司产品;绿康威（20 g/袋）微生物肥，微生物活性成分为内生芽孢杆菌，中农绿康（北京）生物技术有限公司产品。供试对照化学药剂：75%百菌清可湿性粉剂，东菀市瑞德丰生物科技有限公司产品;30%甲霜噁霉灵水剂，河南远见农业科技有限公司产品。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 生防木霉菌对甘蓝的盆栽促生作用试验 将甘蓝种子催芽后播种于人工气候箱，待小苗长出3～4片子叶时移栽至直径为10 cm的塑料钵内，塑料钵内营养土经灭菌处理，用灭菌水浇透，移栽后遮光24 h，之后将塑料钵放入25 ℃、12 h光照/12 h黑暗的温室培养一周后待用。试验共设5个处理，分别以KLSD-8m3、GYYC-15p2、GYSW-3m1和GYXM-1p1分生孢子悬浮液灌根接种（3 mL/株，浓度为106个/mL），以清水为对照。每处理4个重复，共施菌2次（第1次施菌20 d后施第2次菌）。
于第1次施菌后45 d，小心将甘蓝植株整株完整挖出，测量其株高和根长，并称量鲜重（茎叶鲜重、根鲜重和总鲜重），再将植株置于45 ℃烘箱中烘干72 h，称量其干重（茎叶干重、根干重和总干重）（李德全等，2016），统计和评估生防菌对甘蓝植株的促生效果，并计算增幅。
1. 2. 2 微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的田间防效及其促生作用试验 试验在贵州省贵阳市息烽县石洞乡高峰村甘蓝种植基地大田进行，于甘蓝苗移栽2周后施第1次药，30 d后施第2次药，共设11个处理：处理（1）～处理（4），分别以KLSD-8m3、GYYC-15p2、GYSW-3m1和GYXM-1分生孢子液灌根（20 mL/株，分生孢子液浓度106个/mL）;处理（5）沃丰康—复合微生物菌剂穴施（2.5 g/株）;处理（6）沃丰康—克线散粉剂穴施（1.0 g/株）;处理（7）淡紫拟青霉灌根（稀释50倍液，25 mL/株）;处理（8）抗重茬微生态制剂穴施（1.0 g/株）;处理（9）75%百菌清可湿性粉剂稀释喷雾（稀释1000倍液，6.3 g/3小区）作为农药对照;处理（10）30%甲霜噁霉灵稀释喷雾（稀释800倍液，10.0 g/3小区）作为农药对照;处理（11）喷施清水作为空白对照。每处理3个重复（小区），每重复（小区）6.5 m2，每重复（小区）40株甘蓝。 于甘蓝收获期小心将甘蓝植株整株完整挖出并进行调查，方法同1.2.1，测量其株高和根长，称量其叶球鲜重和根鲜重，每处理3重复（小区），每重复（小区）15株。
于甘蓝收获期，对甘蓝叶片黑腐病发病情况进行分级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果，每重复（小区）10株（每株叶片全部调查），3个重复（小区）。参照《农药田间药效试验准则（三）》（姜辉等，2004）制定分级标准。分级标准：0级，叶片无病斑;1级，叶片病斑占整张叶片面积的5%以下;3级，叶片病斑占整张叶片面积的6%～10%;5级，叶片病斑面积占整张叶片面积的11%～25%;7级，叶片病斑面积占整张叶片面积的26%～50%;9级，叶片病斑面积占整张叶片面积的50%以上。
1. 3 统计分析
运用DPS 7.05通过最小显著差异法（LSD）比较不同处理间的差异显著性。
2 结果与分析
2. 1 生防木霉菌对甘蓝的盆栽促生作用
于第1次施菌后45 d调查生防木霉菌对盆栽甘蓝的促生效果，结果（表1和图1-A）显示，4株生防木霉菌对甘蓝植株均有一定的促生作用，其中，GYXM-1p1菌株对甘蓝苗的促生作用最明显，处理后甘蓝植株的株高、根长、茎叶鲜重和干重、根鲜重和干重、植株总鲜重和总干重均显著高于对照（P<0.05，下同），植株总鲜重和总干重分别较对照增加417.60%和762.69%，且对根生长的促进作用更明显，植株根鲜重和根干重分别较清水对照增加865.29%和744.79%;其次是KLSD-8m3和GYSW-3m1菌株，处理后植株的株高、根长、茎叶鲜重和干重、根鲜重和干重、植株总鲜重和总干重均显著高于清水对照;GYYC-15p2菌株的促生作用偏小，与清水对照差异不显著（P>0.05，下同）。
2. 2 微生物菌剂和生防木霉菌对大田甘蓝的促生作用
调查结果（表2、图1-B和图1-C）显示，4株生防木霉菌和4种微生物菌剂对大田甘蓝均有一定的促生作用。经4株生防木霉菌处理的甘蓝株高均高于清水对照，但差异不显著;4种微生物菌剂中以淡紫拟青霉微生物肥处理的甘蓝株高最高，达39.52 cm，且显著高于清水对照和30%甲霜噁霉灵水剂农药对照，与清水对照相比株高增幅为6.80%，其他处理与清水对照和农药对照均无显著差异，其次是沃丰康—复合微生物菌剂和抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理，株高增幅分别为5.92%和5.89%。生防木霉菌、微生物菌剂和农药对照处理的甘蓝叶球鲜重均显著高于清水对照，生防木霉菌和微生物菌剂处理的甘蓝叶球鲜重也明显高于农药对照，4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝叶球鲜重的促生作用最明显，叶球鲜重为1758.89 g/个，叶球鲜重增幅为23.19%;4种微生物菌剂中沃丰康—克线散粉剂对甘蓝叶球的促生作用最显著，叶球鲜重达1882.22 g/个，叶球鲜重增幅为31.83%，其次是抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥，叶球鲜重为1818.89 g/个，增幅为27.39%。4株生防木霉菌中GYSW-3m1菌株对甘蓝根长的促生作用最显著，根长为29.60 cm，根长增幅为22.72%，显著高于其他处理;4种微生物菌剂中淡紫拟青霉微生物肥和抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理的甘蓝根长分别为28.70和28.62 cm，根长增幅分别为18.99%和18.66%。4株生防木霉菌中GYSW-3m1菌株对甘蓝根鲜重的促生作用最明显，根鲜重为34.52 g/株，根鲜重增幅为23.11%，其次是GYXM-1p1菌株，根鲜重为31.36 g/株，根鲜重增幅为11.84%;4种微生物菌剂中抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥处理对甘蓝根鲜重的促生作用最明显，根鲜重为36.54 g/株，根鲜重增幅为30.31%，显著高于清水对照和75%百菌清可湿性粉剂农药对照，其次是淡紫拟青霉微生物肥和沃丰康—克线散粉剂处理，甘蓝根鲜重分别为35.36和34.40 g/株，根鲜重增幅分别为26.11%和22.68%。
2. 3 微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的田间防效
调查结果（表3）显示，所有处理对甘蓝黑腐病均有一定防治效果。4株生防木霉菌中GYYC-15p2菌株對甘蓝黑腐病的防治效果最佳，防效达79.16%，与75%百菌清可湿性粉剂农药对照的防效差异不显著;其次是GYXM-1p1菌株，防效为63.62%。沃丰康—复合微生物菌剂、淡紫拟青霉微生物肥、抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥和沃丰康—克线散粉剂对甘蓝黑腐病的防效分别为67.77%、67.77%、66.29%和57.41%，四者间的防效差异不显著。30%甲霜噁霉灵水剂农药对照对甘蓝黑腐病的防治效果最差，防效仅为36.98%，显著低于GYYC-15p2菌株和75%百菌清可湿性粉剂处理，与其他处理差异不显著。
3 讨论
本研究应用含有不同微生物活性成分的微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝黑腐病的防治效果及其对甘蓝植株的促生作用进行探讨分析，结果表明，不同有效微生物活性成分对甘蓝黑腐病的防治效果及对甘蓝植株的促生增产均有一定作用。4种微生物菌剂中抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥复配处理，有效微生物活性成分包括芽孢杆菌、木霉菌和有益内生芽孢杆菌，其对甘蓝黑腐病的防治效果和甘蓝植株促生作用均较好，防效可达66.29%，叶球鲜重增幅为27.39%，可直接应用于甘蓝黑腐病的防治。本研究结果表明，将芽孢杆菌+木霉菌+有益内生芽孢杆菌复配施用，能充分发挥芽孢杆菌的拮抗作用和木霉菌的拮抗促生作用，实现不同生防机制同时发挥作用，避免单一使用生防菌导致病原微生物产生抗性的问题。4株生防木霉菌中GYXM-1p1菌株对甘蓝黑腐病的防治效果和甘蓝植株促生作用也较好，对甘蓝黑腐病的防效为63.62%，能使植株总鲜重和总干重分别较清水对照增加417.60%和762.69%。在前人的研究报道中，主要以芽孢杆菌防治甘蓝黑腐病，应用真菌特别是生防木霉菌防治甘蓝黑腐病的研究鲜见报道。木霉菌（Trichoderma spp.）是一类优秀的生防有益菌，不仅对植物病原真菌具有广谱拮抗性，还具有促进植物生长的作用（Altomare et al.，1999;张丽荣等，2018）。木霉菌作用的靶标微生物多为真菌，但由于木霉菌的竞争能力较强，且其产生的某些次级代谢产物常具有抗细菌活性，梁小蕊（2016）报道从桔绿木霉菌cf27发酵粗提物中分离得到的二萜化合物（TC2）对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）具有明显抑制效果。本研究结果表明，木霉菌能通过某些生防作用机制抑制细菌病原菌生长，其中GYXM-1p1菌株可作为一种重要的生防资源应用于甘蓝黑腐病防治，具有一定的开发潜力。 参考已有研究报道（潘青仙和金灵占，2004;黄美玲，2012）并结合生产实际，本研究中微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝大田促生作用的影响主要表现在增加单球鲜重（净菜重）上，在2017年的结球甘蓝价格水平下各微生物菌剂和生防木霉菌施用处理后甘蓝的增产增收效果显著。2017年甘蓝市场平均批发价为0.6元/kg（当地收购价格），每公顷约40500株（当地种植密度）（周文美，2016），与当地农户甘蓝种植情况相比（平均单球重1700 g），沃丰康—克线散粉剂、抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥、沃丰康—复合微生物菌剂和淡紫拟青霉微生物肥处理后分别增收4427.95、2889.03、2106.08和1295.92元/ha，GYXM-1p1菌株处理能增收1431.03元/ha;此外，甘蓝的市场价格还取决于其商品性，甘蓝黑腐病的发病程度严重影响甘蓝的商品性。因此，本研究主要是综合微生物菌剂和生防木霉菌对甘蓝的增产促生作用和对甘蓝黑腐病的防治作用进行菌剂筛选。
4 结论
生防木霉菌GYXM-1p1菌株具有拮抗和促生双重作用，可作为生防资源应用于甘蓝黑腐病防治，具有一定的开发潜力;抗重茬微生态制剂+绿康威微生物肥复配处理能充分发挥不同微生物活性成分的拮抗促生作用，实现不同生防机制同时发挥作用，可直接应用于大田甘蓝黑腐病的防治。
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