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关键词：枯草芽孢杆菌;褶皱臂尾轮虫;酵母;温度调控;种群增长
褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）是海水鱼、虾、蟹等水产幼苗生长发育期间不可或缺的饵料生物，“育好苗先培好虫”这句行话说明轮虫培育是育苗产业上不可缺少的关键一环。褶皱臂尾轮虫食性广泛，生产上主要以投喂单胞藻为主，但土池生产中单胞藻的接种和培育受天气环境等不可控因素的影响较大，工厂化生产中单胞藻的接种和培育则受场地限制等因素影响较大，因此单胞藻产量极其不稳定，池塘内常常因为出现藻类的快速演替，从而导致轮虫饵料短缺的问题，严重影响育苗产业的经济效益。在单胞藻缺乏时，酵母是被广泛运用的轮虫基础饵料，20世纪60年代Hirata发现可以用面包酵母培养海水轮虫[1]，20世纪70年代海水小球藻与面包酵母培养轮虫的模式被广泛推广[2]，相比小球藻，酵母生产厂家众多，可获得性好，发酵条件简单，成本低廉，可在短时间内替代单胞藻作为轮虫的主要饵料，酵母已经被证实可用于轮虫高密度生产养殖，可保证在单胞藻供应不足情况下维持轮虫的存活和生长。但相关研究已经证实单独用酵母培养的轮虫，易产生营养缺乏症状，如今轮虫营养强化的研究涉及到藻类和酵母搭配光合细菌、鱼油、维生素B12和维生素C等[3-8]，甘松永等用酵母与枯草芽孢杆菌作为轮虫饵料进行高密度培养，结果证实酵母和芽孢杆菌可用作饵料培养[9]。
本试验针对枯草芽孢杆菌生长特性及配合酵母投喂后对轮虫种群生殖的影响作进一步研究，以期获得枯草芽孢杆菌与酵母搭配的最佳添加浓度和控制温度，尽可能为实际生产当中所遇到的问题提供数据支持，也为轮虫营养强化提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料的准备
本试验中使用的试验菌株为枯草芽孢杆菌粉活化后分离筛选得到，经生物性状和培养试验鉴定为合格的水产养殖专用枯草芽孢杆菌菌株，枯草芽孢杆菌菌粉购自济宁金山生物工程有限公司。
本试验使用的褶皱臂尾轮虫为盐城射阳海水育苗基地轮虫养殖池塘内取塘口底泥休眠卵孵化而来，试验室孵化后进行单个体纯化培养，纯化培养后收集休眠卵以保种，轮虫培养液采用人工海水配方，并每天更换培养液，培养条件：光照度约为 4 000 lx，昼夜比为 16 h ∶ 8 h。
种子培养基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、015%牛肉膏，pH值7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。
液体培养基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、030% K2HPO3、0.10% 30.8 mg/L MnSO4、0.70% CaCO3、0.05% MgSO4·7H2O、0.01% FeCl3，pH值为7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。
斜面培养基：将15 g营养琼脂溶入1 000 mL液体培养基中，121 ℃灭菌30 min，趁热倒入已灭菌的培养皿，4 ℃冷藏。
酵母轮虫基础食物悬液：取干酵母加入浓度为1.5%葡萄糖培养基，温度为25 ℃，活化30 min后，以22 ℃、5 500 r/min离心去除葡萄糖培养基，加入人工海水配成浓度为6×106个/mL酵母液备用。高活性干酵母购自安琪酵母股份有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 枯草芽孢杆菌活菌生长曲线的测定方法 在无菌操作台下，将4 ℃保存的斜面培养基菌株接入已灭菌的新斜面培养基中，置于菌种培养箱 37 ℃ 活化24 h后接种到100 mL种子培养基中，37 ℃，200 r/min，摇床振荡培养24 h。将培养后的种子液按7%的接种量接入已灭菌的100 mL液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养枯草芽孢杆菌母液，培养0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h时对枯草芽孢杆菌进行计数。测定各时间点活菌数量时用1 mL无菌吸管吸取1 mL母液的菌悬液，加入9 mL无菌人工海水混匀成1 ∶ 10稀释比例的菌悬液，这样依次稀释，直至得到1 ∶ 105、1 ∶ 106、1 ∶ 107、1 ∶ 108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010等浓度，每次稀释更换无菌吸管，以上每个浓度设置3次重复。向每个灭菌培养皿中倒入约10 mL已灭菌的液体培养基，混合均匀，待凝固后备用，用 1 mL 无菌吸管分别吸取不同稀释浓度活菌悬液 0.1 mL，加至已凝固好的培養基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置 30 min 后，倒置于37 ℃的恒温培养箱内培养18～24 h，对同一梯度平行平板菌落数进行统计，计算平均值，根据稀释倍数和取样接种量换算样品中活菌含量。
1.2.2 轮虫种群动态研究方法 取冷藏保存的轮虫休眠卵，放入海水培养液中，在自然光照、25 ℃条件下进行孵化，并于16～24 h内观察发育状况，发育形成稳定的群体后，挑取出日龄4 h以内的轮虫幼体置于一次性细胞培养板（6孔）中，每孔加入 5 mL 试验溶液，每孔5只轮虫幼体，每组设置6个平行;在枯草芽孢杆菌刚进入对数生长期的时间点联合酵母配成试验溶液，根据预试验结果，当枯草芽孢杆菌的浓度超过1 000 mg/L时对轮虫生长开始有抑制作用，设置枯草芽孢杆菌的浓度梯度为0（对照组）、100、200、300、500、800 mg/L，设置培养箱光照度为 4 000 lx，昼夜比为16 h ∶ 8 h，温度分别设置为 20、25、30 ℃。每次间隔24 h镜检并更换培养液，连续观察10 d，对轮虫个体数进行计数，统计轮虫种群数量、日种群增长率以及种群密度等。
1.3 数据处理
种群密度=种群总数/培养体积。种群密度单位为ind./mL。
根据收集的试验数据，采用Excel作初步处理，再用Sigma Plot 11.0软件进行处理。根据试验设计，对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行多重比较，结果用平均值±标准差的形式表示。 2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线测定
在培养0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h时对枯草芽孢杆菌活菌数进行记录，以活菌数量的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，绘制活性菌株生长曲线，由图1可知，枯草芽孢杆菌菌株从种子培养基接入液体培养基后经历了4个生长时期，分别为延迟期、对数生长期、稳定期和衰退期，0～4 h为延迟期，4～10 h进入对数增长期，活菌的数量呈指数型增长，峰值约达到1.1×1010CFU/mL后进入稳定期，稳定期为10～24 h，活菌总体数量基本保持不变，24 h后进入衰退期，活菌数量下降。因此，活化菌的时间应控制在4 h左右，此时菌株刚进入对数生长期，细菌形态典型、生物活性强。
2.2 20 ℃下不同浓度枯草芽孢杆菌联合酵母对轮虫种群的影响
2.2.1 20 ℃条件下轮虫种群动态 20 ℃时，褶皱臂尾轮虫在不同浓度枯草芽孢杆菌中种群动态变化
见图2，轮虫种群数量随枯草芽孢杆菌的浓度升高先上升再降低。对照组最大种群容纳量为 324 ind.，100、200、300、500、800 mg/L枯草芽孢杆菌处理组最大种群容纳量分别为343、369、375、402、356 ind.。在种群起始密度均为1.0 ind./mL的情况下，除 300 mg/L 枯草芽孢杆菌处理组在第10天才到达种群数量高峰外，其他各处理组和对照组均在第9天达到种群数量高峰，之后种群数量呈下降趋势。
2.2.2 20 ℃条件下轮虫种群增长率 褶皱臂尾轮虫在20 ℃条件下不同浓度枯草芽孢杆菌日种群增长率见图3，试验组种群增长率始终高于对照组，500 mg/L枯草芽孢杆菌试验处理组在第5天达到各试验组中最大种群增长率，为16.3%，明显高于对照组，各组种群增长率均随时间先上升后下降。对照组在第5天达到峰值，处理组种群增长率峰值出现时间均与对照组一致。
2.2.3 20 ℃条件下轮虫种群密度 20 ℃时，轮虫在不同浓度枯草芽孢杆菌中种群密度变化见图4。第2天，对照组与各试验处理组种群密度差异较小。第3天，各处理组与对照组相比种群密度显著增大（P
褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）是海水鱼、虾、蟹等水产幼苗生长发育期间不可或缺的饵料生物，“育好苗先培好虫”这句行话说明轮虫培育是育苗产业上不可缺少的关键一环。褶皱臂尾轮虫食性广泛，生产上主要以投喂单胞藻为主，但土池生产中单胞藻的接种和培育受天气环境等不可控因素的影响较大，工厂化生产中单胞藻的接种和培育则受场地限制等因素影响较大，因此单胞藻产量极其不稳定，池塘内常常因为出现藻类的快速演替，从而导致轮虫饵料短缺的问题，严重影响育苗产业的经济效益。在单胞藻缺乏时，酵母是被广泛运用的轮虫基础饵料，20世纪60年代Hirata发现可以用面包酵母培养海水轮虫[1]，20世纪70年代海水小球藻与面包酵母培养轮虫的模式被广泛推广[2]，相比小球藻，酵母生产厂家众多，可获得性好，发酵条件简单，成本低廉，可在短时间内替代单胞藻作为轮虫的主要饵料，酵母已经被证实可用于轮虫高密度生产养殖，可保证在单胞藻供应不足情况下维持轮虫的存活和生长。但相关研究已经证实单独用酵母培养的轮虫，易产生营养缺乏症状，如今轮虫营养强化的研究涉及到藻类和酵母搭配光合细菌、鱼油、维生素B12和维生素C等[3-8]，甘松永等用酵母与枯草芽孢杆菌作为轮虫饵料进行高密度培养，结果证实酵母和芽孢杆菌可用作饵料培养[9]。
本试验针对枯草芽孢杆菌生长特性及配合酵母投喂后对轮虫种群生殖的影响作进一步研究，以期获得枯草芽孢杆菌与酵母搭配的最佳添加浓度和控制温度，尽可能为实际生产当中所遇到的问题提供数据支持，也为轮虫营养强化提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料的准备
本试验中使用的试验菌株为枯草芽孢杆菌粉活化后分离筛选得到，经生物性状和培养试验鉴定为合格的水产养殖专用枯草芽孢杆菌菌株，枯草芽孢杆菌菌粉购自济宁金山生物工程有限公司。
本试验使用的褶皱臂尾轮虫为盐城射阳海水育苗基地轮虫养殖池塘内取塘口底泥休眠卵孵化而来，试验室孵化后进行单个体纯化培养，纯化培养后收集休眠卵以保种，轮虫培养液采用人工海水配方，并每天更换培养液，培养条件：光照度约为 4 000 lx，昼夜比为 16 h ∶ 8 h。
种子培养基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、015%牛肉膏，pH值7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。
液体培养基：1.50%葡萄糖、1.50%蛋白胨、030% K2HPO3、0.10% 30.8 mg/L MnSO4、0.70% CaCO3、0.05% MgSO4·7H2O、0.01% FeCl3，pH值为7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。
斜面培养基：将15 g营养琼脂溶入1 000 mL液体培养基中，121 ℃灭菌30 min，趁热倒入已灭菌的培养皿，4 ℃冷藏。
酵母轮虫基础食物悬液：取干酵母加入浓度为1.5%葡萄糖培养基，温度为25 ℃，活化30 min后，以22 ℃、5 500 r/min离心去除葡萄糖培养基，加入人工海水配成浓度为6×106个/mL酵母液备用。高活性干酵母购自安琪酵母股份有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 枯草芽孢杆菌活菌生长曲线的测定方法 在无菌操作台下，将4 ℃保存的斜面培养基菌株接入已灭菌的新斜面培养基中，置于菌种培养箱 37 ℃ 活化24 h后接种到100 mL种子培养基中，37 ℃，200 r/min，摇床振荡培养24 h。将培养后的种子液按7%的接种量接入已灭菌的100 mL液体培养基中，37 ℃、200 r/min摇床振荡培养枯草芽孢杆菌母液，培养0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h时对枯草芽孢杆菌进行计数。测定各时间点活菌数量时用1 mL无菌吸管吸取1 mL母液的菌悬液，加入9 mL无菌人工海水混匀成1 ∶ 10稀释比例的菌悬液，这样依次稀释，直至得到1 ∶ 105、1 ∶ 106、1 ∶ 107、1 ∶ 108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010等浓度，每次稀释更换无菌吸管，以上每个浓度设置3次重复。向每个灭菌培养皿中倒入约10 mL已灭菌的液体培养基，混合均匀，待凝固后备用，用 1 mL 无菌吸管分别吸取不同稀释浓度活菌悬液 0.1 mL，加至已凝固好的培養基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置 30 min 后，倒置于37 ℃的恒温培养箱内培养18～24 h，对同一梯度平行平板菌落数进行统计，计算平均值，根据稀释倍数和取样接种量换算样品中活菌含量。
1.2.2 轮虫种群动态研究方法 取冷藏保存的轮虫休眠卵，放入海水培养液中，在自然光照、25 ℃条件下进行孵化，并于16～24 h内观察发育状况，发育形成稳定的群体后，挑取出日龄4 h以内的轮虫幼体置于一次性细胞培养板（6孔）中，每孔加入 5 mL 试验溶液，每孔5只轮虫幼体，每组设置6个平行;在枯草芽孢杆菌刚进入对数生长期的时间点联合酵母配成试验溶液，根据预试验结果，当枯草芽孢杆菌的浓度超过1 000 mg/L时对轮虫生长开始有抑制作用，设置枯草芽孢杆菌的浓度梯度为0（对照组）、100、200、300、500、800 mg/L，设置培养箱光照度为 4 000 lx，昼夜比为16 h ∶ 8 h，温度分别设置为 20、25、30 ℃。每次间隔24 h镜检并更换培养液，连续观察10 d，对轮虫个体数进行计数，统计轮虫种群数量、日种群增长率以及种群密度等。
1.3 数据处理
种群密度=种群总数/培养体积。种群密度单位为ind./mL。
根据收集的试验数据，采用Excel作初步处理，再用Sigma Plot 11.0软件进行处理。根据试验设计，对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行多重比较，结果用平均值±标准差的形式表示。 2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线测定
在培养0、1、3、5、7、10、12、15、20、24、28 h时对枯草芽孢杆菌活菌数进行记录，以活菌数量的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，绘制活性菌株生长曲线，由图1可知，枯草芽孢杆菌菌株从种子培养基接入液体培养基后经历了4个生长时期，分别为延迟期、对数生长期、稳定期和衰退期，0～4 h为延迟期，4～10 h进入对数增长期，活菌的数量呈指数型增长，峰值约达到1.1×1010CFU/mL后进入稳定期，稳定期为10～24 h，活菌总体数量基本保持不变，24 h后进入衰退期，活菌数量下降。因此，活化菌的时间应控制在4 h左右，此时菌株刚进入对数生长期，细菌形态典型、生物活性强。
2.2 20 ℃下不同浓度枯草芽孢杆菌联合酵母对轮虫种群的影响
2.2.1 20 ℃条件下轮虫种群动态 20 ℃时，褶皱臂尾轮虫在不同浓度枯草芽孢杆菌中种群动态变化
见图2，轮虫种群数量随枯草芽孢杆菌的浓度升高先上升再降低。对照组最大种群容纳量为 324 ind.，100、200、300、500、800 mg/L枯草芽孢杆菌处理组最大种群容纳量分别为343、369、375、402、356 ind.。在种群起始密度均为1.0 ind./mL的情况下，除 300 mg/L 枯草芽孢杆菌处理组在第10天才到达种群数量高峰外，其他各处理组和对照组均在第9天达到种群数量高峰，之后种群数量呈下降趋势。
2.2.2 20 ℃条件下轮虫种群增长率 褶皱臂尾轮虫在20 ℃条件下不同浓度枯草芽孢杆菌日种群增长率见图3，试验组种群增长率始终高于对照组，500 mg/L枯草芽孢杆菌试验处理组在第5天达到各试验组中最大种群增长率，为16.3%，明显高于对照组，各组种群增长率均随时间先上升后下降。对照组在第5天达到峰值，处理组种群增长率峰值出现时间均与对照组一致。
2.2.3 20 ℃条件下轮虫种群密度 20 ℃时，轮虫在不同浓度枯草芽孢杆菌中种群密度变化见图4。第2天，对照组与各试验处理组种群密度差异较小。第3天，各处理组与对照组相比种群密度显著增大（P