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摘要 [目的]定位并比较不同日龄建昌黑山羊睾丸及附睾中GnRHR的分布及表达情况。[方法]分别收集55、104、300、1 140日龄建昌黑山羊的睾丸、附睾头和附睾尾组织，然后进行脱水、包埋、切片后，采用免疫组化定位GnRHR在各个组织中的分布。[结果]GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾头和附睾尾组织细胞中均有分布，在上皮下层、基质层中分布较多，其表达量在300日龄的附睾尾和1 140日龄的睾丸中达到较高水平。[结论]GnRHR在睾丸、附睾中均有表达，而且不同日龄阶段表达存在组织细胞特异性。
关键词 促性腺激素释放激素受体；睾丸；附睾；建昌黑山羊
中图分类号 S827 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0103-04
Localization and Distribution of GnRHR in the Testis and Epididymis from Different Age of Jianchang Black Goat
HOU Zhen-zhen1，ZHANG Yi2，ZHANG Ming1*
（1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan，611130；2.School of Animal Science and Technology，Xichang College，Xichang，Sichuan 615000）
Abstract [Objective]To localize and compare the distribution and expression level of GnRHR in the testis and epididymis from different age of Jianchang black goat.[Method]The testis and epididymis were collected at 55，104，104，1 140 d after animal birth，then dehydrated，embedded and cut.Distribution of GnRHR was orientated by immunohistochemical assay.[Result]GnRHR in the testis，epididymal heads and tails，especially in subepithelial layer and stroma layer，in which had a higher expression level than other tissue was expressed.GnRHR expression was the most in the epididymis at 300 d and in the testis at 1 140 d.[Conclusion] GnRHR is expressed in the testis and epididymis，and its expression level has tissue-specificity at different age.
Abstract Gonadotropin Releasing Hormone receptor； Testis； Epididymis；Jianchang black goat
繁殖是生物物種延续最基本的生命活动，而动物繁殖必须依赖体内的繁殖调节物质。促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH） 是下丘脑分泌的十肽，是下丘脑-垂体-性腺轴的关键调节因子[1]，对于哺乳动物生殖器官发育和生理机能的维持起着关键的调节作用。GnRH作用的发挥依赖于促性腺激素释放激素受体（Gonadotropin Releasing Hormone receptor，GnRHR） 的存在。GnRHR和GnRH 结合进而激发信号通路，并主要促使促黄体生成素 （LH） 和促卵泡素（FSH） 的合成与释放，参与动物机体的繁殖调控[2-3]。
建昌黑山羊是四川省地方优良品种，广泛分布于凉山彝族自治州。该山羊耐粗饲，易管理，抗病力强，繁殖力高，在当地地方经济发展中占重要的地位[4]。目前有关雄性建昌黑山羊生殖生理的基础研究很少。研究人员发现，抑制实验动物和人的GnRH基因和GnRHR基因表达，会显著抑制其生殖活动[5-6]。Ikemoto等[7]认为GnRH 与其受体的相互作用在生殖功能中起着关键性的作用。也有资料显示山羊GnRHR基因的突变与其繁殖性能有关，可能是影响山羊繁殖率的一个因素[8]。相关定位研究显示GnRHR除主要分布在垂体促性腺细胞外[9]，在卵巢、睾丸、前列腺、性腺等组织细胞上也存在着GnRH特异结合位点[10-11]。
近年来，许多科研人员将GnRHR基因作为影响山羊繁殖性能的候选基因来研究[8]。但迄今为止，GnRHR在建昌黑山羊雄性生殖器官上发育性表达和分布的研究很少。该研究利用免疫组化，定位分析不同日龄阶段山羊睾丸、附睾头、附睾尾中GnRHR的分布情况，以期为深入了解建昌黑山羊雄性生殖生理提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物。分别选择55、104、300和1 140 d 这4个日龄的建昌黑山羊公羊各2只。自然条件下使其自由饮水与采食，并分开饲养。进行麻醉后，外科手术收集睾丸、附睾头和附睾尾组织，用于组织切片和免疫组化（IHC）定位[12-13]GnRHR。实验动物的处理符合动物福利相关法律。 1.1.2 仪器。切片机（Lecia RM-235德国莱卡公司）；恒温平板（HB-2000）；电热恒温干燥箱；显微镜（Olympus BX-51，日本）；超纯水系统（美国Millipore公司）；超低温冰箱-80 ℃（Thermo，美国Thermo公司）。
1.1.3 试剂。二甲苯，乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%），磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钾，氯化钙，氯化钠，吐温20，胰蛋白酶，山羊血清，3%H2O2，甲醇等为国产分析纯。一抗（兔抗），二抗（山羊抗兔），来自Santa cruz公司；兔抗山羊SABC试剂盒，苏木精，DAB显色试剂来自博士德。
1.1.4 溶液配制
1.1.4.1 免疫组化稀释比。用1倍PBS液稀释一抗（1∶200），血清（1∶10），二抗（1∶100），SABC（1∶100）；DAB试剂用超纯水稀释（1∶20）；试剂A、B、C各50 μL，1 mL超纯水。
1.1.4.2 配制PBS洗涤液。
配制5倍PBS液：氯化钾1 g、磷酸氢二钠14.5 g、磷酸二氢钾1.35 g、氯化钠40 g，1 000 mL蒸馏水；配制1倍PBS液：500 mL的5倍PBS液，2 000 mL蒸馏水。另外加吐温的PBS液再加750 μL吐温混匀即可。
1.1.4.3 配制0.05%胰蛋白酶工作液。
先配制0.5%的胰蛋白酶储藏液：用50 mg胰蛋白酶干粉与10 mL纯水混匀，-20 ℃冰箱保存；再配制1% CaCl2溶液：用0.1 g CaCl2与10 mL纯水混匀，4 ℃冰箱保存；0.05%胰蛋白酶工作液即用1 mL 0.5%胰蛋白酶储藏液加1 mL 1% CaCl2溶液再加8 mL纯水，混匀即可。
1.1.4.4 配制3%过氧化氢液。30% H2O2 40 mL、甲醇360 mL，搅拌混匀即可。
1.2 方法
1.2.1 石蜡组织切片的制作。
收集睾丸、附睾头和附睾尾组织，放入10% 中性福尔马林浸泡2～3 d，修块并置于包埋盒内，再次浸泡在10% 中性福尔马林中3～5 d固定；之后用自来水冲洗12 h，依次在70%、80%、90%、95%、99%、100%乙醇溶液，3个二甲苯溶液，3个蜡缸中进行组织脱水透蜡，再进行石蜡包埋；之后进行石蜡切片，切片厚度为4 μm，每个日龄公羊睾丸、附睾头和附睾尾3个组织，各切3张片子，切片后用纸条将切片放入45 ℃水中使其充分展开，再用载玻片接触切片使其贴片，然后放于50 ℃热台烘干，45 ℃烘片48 h。
1.2.2 脱蜡。
把切片放在载玻片架内，放入二甲苯中连续透明处理2次，各脱蜡1 min；脱蜡后，把切片依次放入不同浓度的乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%）溶液中，各30 s，脱蜡。脱蜡完成后放到烧杯中，在缓慢又小的自来水流下冲洗10 min。
1.2.3 抗原修复。
酶消化法：用0.05%胰蛋白酶工作液修复。在玻片上滴加胰蛋白酶液，覆盖住组织，将玻片放于37～38 ℃的热台上，消化15 min，然后轻轻甩干玻片上残余的胰蛋白酶，将玻片放于玻片架上，流水浸泡5～10 min。
1.2.4 灭活内源性过氧化物酶。将玻片浸泡于3% H2O2液10 min进行内源性过氧化物酶灭活。
1.2.5 滴加血清和一抗孵育。
切片用3% H2O2浸泡过后取出，把切片放到装有PBS洗涤液浸泡3次，每次5 min。取出浸泡的切片，将切片快速地轻放在暗盒里，然后迅速滴加正常山羊血清稀释液，盖住切片上的组织，盖上盖子，室温孵育30 min。
孵育過后，快速地将之前滴加在切片上的血清甩干净（注意此过程禁止用其他任何溶液冲洗，自然甩干即可），然后迅速地滴加一抗（兔抗、阴性对照滴加PBS液）盖住之前血清盖住的切片组织处，放回暗盒里并盖上盖子，放入冰箱（4 ℃）过夜（间隔12～16 h，14 h左右效果最佳）。
1.2.6 二抗孵育。将盒子从冰箱（4 ℃）中拿出，把切片放到载玻片架内，放入烧杯中用PBS洗涤液连续浸泡3次，每次5 min（此处阴性对照要与GnRHR组织样分开漂洗）。漂洗结束后，把切片放入暗盒里，快速滴加二抗（山羊抗兔），淹盖住组织，室温孵育1 h。
1.2.7 滴加SABC。孵育结束后，把所有的切片都放在同一载玻片架内，并放入烧杯中用PBS洗涤液连续浸泡3次，每次5 min。浸泡完成后，将切片放回暗盒内，快速滴加SABC，淹盖住组织，室温孵育1 h。
1.2.8 显色。
从暗盒里取出切片，装在载玻片架内，并依次放入4个烧杯（第1个烧杯1倍PBS溶液加有吐温，第2个无吐温，第3个有吐温，第4个无吐温）中浸泡，每个烧杯中浸泡5 min。浸泡结束后，将切片放回盒内，按照确定好的GnRHR的显色时间，快速滴加DAB进行显色，每次显色2张载玻片。每次显色时间到后，迅速将片子放入装有清水的烧杯中，洗去载玻片上的DAB液，将片子放在载玻片架里并放入烧杯中。所有片子DAB显色完后，放在自来水下缓慢冲洗3 min；接着进行苏木精染色，染色时间为30 s，每次3张载玻片最佳，每次显色时间到后，迅速将片子放入装有清水的烧杯中，洗去多余的苏木精，把片子放在载玻片架里并放入烧杯中。所有片子染色完后，放在自来水下缓慢冲洗5 min。DAB显色时间约为90 s，苏木精染色时间约为30 s。
1.2.9 脱水。
缓慢冲洗结束后，将切片快速地依次放入不同浓度的乙醇（70%、80%、90%、95%、99%、100%）中脱水，且快速地放入装有二甲苯玻璃瓶中连续透明处理2次，每次1 min，最后放到二甲苯的中待封片。 1.2.10 封片。由于二甲苯挥发比较快，封片速度要快，树脂要适量且不要太稀。
1.2.11 图像观察。不同日龄不同组织分别选取2张切片，每张切片选择视野清晰处在显微镜下成像并拍照。根据阴性对照确定特异性标记，采用Image Pro Plus （IPP）6.0软件分析图像[14]，分别测量睾丸、附睾头和附睾尾中有阳性染色的组织区域（AOI）的光密度（OD）[15-16]，根据GnRHR在睾丸、附睾头和附睾尾中的分布及表达量，呈阳性显色记为+（1～3分）；阳性显色明显记为++（4～7分）；阳性显色最强记为+++（8～10分）。
2 结果与分析
2.1 GnRHR在睾丸、附睾组织中的分布 由图1可知，在55、104、300、1 140 d这4个日龄的建昌黑山羊的附睾头、附睾尾中均有GnRHR的表达。在附睾头中，55 d和104 d的GnRHR主要分布在附睾管上皮下层和基质层中；300 d和1 140 d时，GnRHR的表达量明显增加，在上皮层中有少量分布，在上皮下层与基质层中分布较多。附睾尾中，55 d和104 d时的GnRHR主要分布在基质层中；300 d和1 140 d时，GnRHR在上皮细胞层、上皮下层及基质层中均有表达。在睾丸中，支持细胞中的GnRHR分布很少；55 d和104 d时，GnRHR主要分布在间质细胞中；300 d和1 140 d时，GnRHR在间质细胞和生精细胞上均有分布。
2.2 不同日龄阶段建昌黑山羊睾丸、附睾中GnRHR表达水平
根据免疫组化评分，将染色结果定为3个等级。GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾中的表达情况见表1。
试验结果显示：在睾丸中，55 d时，间质细胞染色程度较浅，但在104、300、1 140 d时，阳性显色程度逐渐增加，在1 140 d时阳性显色最强，GnRHR呈高水平表达；而支持细胞和生精细胞在55 d和104 d时几乎未表达，支持细胞在300、1 140 d时表达很弱，生精细胞在300 d和1 140 d时表达水平相同，阳性显色明显。附睾中，附睾头和附睾尾上皮层GnRHR在55、104 d时均未表达，在300、1 140 d时表达较弱；从55 d到1 140 d，附睾头上皮下层和基质层中的表达量由低到高，在1 140 d时阳性显色最强；附睾尾上皮下层在300 d和1 140 d时表达量较高，而基质层在104、300、1 140 d的表达量相同。以上结果表明，阳性表达部位主要是在睾丸的间质细胞和生精细胞以及附睾的上皮下层和基质层。另外，GnRHR免疫反应产物随日龄的增加呈阳性表达的量也随之增加，且在1 140日龄表达量达到最高。
3 讨论与结论
此次免疫组化试验中，发现GnRHR在建昌黑山羊的睾丸和附睾中都有分布，但不同日龄阶段表达量有一定差异，且呈现由低到高的现象。
促性腺激素释放激素受体（GnRHR）是GnRH对动物体的生物效应介导者，在体内广泛分布。研究发现，在垂体促性腺激素分泌细胞的细胞膜上存在着相对分子质量约100 kD的GnRHR受体[17]，此次试验在睾丸、附睾中也发现其受体的存在。GnRHR属GnRH结合蛋白偶联体系的家族成员[18]，且GnRH本身及性甾体激素、抑制素、激活素等都对GnRHR的表达具有调节作用[19]，而动物体内的激素分泌同样与其生长发育程度有关。通过免疫组化染色试验，可以发现在55 d时，睾丸、附睾中的GnRHR表达量很低甚至没有表达，可能是由于山羊处于发育初期，体内激素分泌并不旺盛；104 d时，在睾丸间质细胞与附睾的上皮下层和基质层中，发现其阳性显色明显，表明山羊此期处于性腺的发育阶段，而GnRHR可能对山羊的生殖系统发育有促进作用，促进性腺的成熟；在300 d和1 140 d时，GnRHR的表达量明显增加，尤其是在睪丸的间质细胞、生精细胞以及附睾的上皮下层、基质层中表达量加强，可能是由于山羊已达到配种繁殖年龄，其生殖器官发育成熟，并具有生精能力，GnRHR在此时可能起到了促进精子成熟及促进精子运动的作用。在55、104、300、1 140 d这4个日龄的雄山羊睾丸、附睾组织结构中，GnRHR在1 140日龄时表达量最高。山羊的繁殖年限一般为8年左右，在3～6岁达到最佳繁殖年龄[20]。由于试验所选用的组织最大日龄限于1 140日龄，正好在山羊的3岁左右，由此可以判断，此时山羊繁殖能力强，促性腺激素释放激素分泌较为旺盛，可能与其受体结合程度也较高。
综上所述，GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾中均有表达，而且不同日龄阶段表达存在组织特异性。
参考文献
[1] 李志惠，李德.榕江小香羊GnRHR基因cDNA克隆及生物信息学分析 [J].黑龙江畜牧兽医，2015（9）：110-112.
[2] HAPGOOD J P，SADIE H，VAN BILJON W，et al.Regulation of mammalian gonadotrophin-releasing hormone receptor genes[J].Journal of neuroendocrinology，2005，17（10）：619-638.
[3] 柳楠，马晓丽，程明，等.GnRHR基因多态性与崂山奶山羊产羔数的关联分析[J].华北农学报，2014，29（6）：78-83.
[4] 李天海.建昌黑山羊简介[J].四川畜牧兽医，2001，28（1）：40.
[5] 徐睿.GnRHR基因部分序列多态性及其与会理黑山羊产羔数相关性研究[J].中国畜牧杂志，2015，51（15）：16-19.
[6] KIM J H，KIM H J，NOH H S，et al.Suppression by ethanol of male productive activity[J].Brain Res，2003，989（1）：91-98.
关键词 促性腺激素释放激素受体；睾丸；附睾；建昌黑山羊
中图分类号 S827 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0103-04
Localization and Distribution of GnRHR in the Testis and Epididymis from Different Age of Jianchang Black Goat
HOU Zhen-zhen1，ZHANG Yi2，ZHANG Ming1*
（1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Wenjiang，Sichuan，611130；2.School of Animal Science and Technology，Xichang College，Xichang，Sichuan 615000）
Abstract [Objective]To localize and compare the distribution and expression level of GnRHR in the testis and epididymis from different age of Jianchang black goat.[Method]The testis and epididymis were collected at 55，104，104，1 140 d after animal birth，then dehydrated，embedded and cut.Distribution of GnRHR was orientated by immunohistochemical assay.[Result]GnRHR in the testis，epididymal heads and tails，especially in subepithelial layer and stroma layer，in which had a higher expression level than other tissue was expressed.GnRHR expression was the most in the epididymis at 300 d and in the testis at 1 140 d.[Conclusion] GnRHR is expressed in the testis and epididymis，and its expression level has tissue-specificity at different age.
Abstract Gonadotropin Releasing Hormone receptor； Testis； Epididymis；Jianchang black goat
繁殖是生物物種延续最基本的生命活动，而动物繁殖必须依赖体内的繁殖调节物质。促性腺激素释放激素（Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH） 是下丘脑分泌的十肽，是下丘脑-垂体-性腺轴的关键调节因子[1]，对于哺乳动物生殖器官发育和生理机能的维持起着关键的调节作用。GnRH作用的发挥依赖于促性腺激素释放激素受体（Gonadotropin Releasing Hormone receptor，GnRHR） 的存在。GnRHR和GnRH 结合进而激发信号通路，并主要促使促黄体生成素 （LH） 和促卵泡素（FSH） 的合成与释放，参与动物机体的繁殖调控[2-3]。
建昌黑山羊是四川省地方优良品种，广泛分布于凉山彝族自治州。该山羊耐粗饲，易管理，抗病力强，繁殖力高，在当地地方经济发展中占重要的地位[4]。目前有关雄性建昌黑山羊生殖生理的基础研究很少。研究人员发现，抑制实验动物和人的GnRH基因和GnRHR基因表达，会显著抑制其生殖活动[5-6]。Ikemoto等[7]认为GnRH 与其受体的相互作用在生殖功能中起着关键性的作用。也有资料显示山羊GnRHR基因的突变与其繁殖性能有关，可能是影响山羊繁殖率的一个因素[8]。相关定位研究显示GnRHR除主要分布在垂体促性腺细胞外[9]，在卵巢、睾丸、前列腺、性腺等组织细胞上也存在着GnRH特异结合位点[10-11]。
近年来，许多科研人员将GnRHR基因作为影响山羊繁殖性能的候选基因来研究[8]。但迄今为止，GnRHR在建昌黑山羊雄性生殖器官上发育性表达和分布的研究很少。该研究利用免疫组化，定位分析不同日龄阶段山羊睾丸、附睾头、附睾尾中GnRHR的分布情况，以期为深入了解建昌黑山羊雄性生殖生理提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物。分别选择55、104、300和1 140 d 这4个日龄的建昌黑山羊公羊各2只。自然条件下使其自由饮水与采食，并分开饲养。进行麻醉后，外科手术收集睾丸、附睾头和附睾尾组织，用于组织切片和免疫组化（IHC）定位[12-13]GnRHR。实验动物的处理符合动物福利相关法律。 1.1.2 仪器。切片机（Lecia RM-235德国莱卡公司）；恒温平板（HB-2000）；电热恒温干燥箱；显微镜（Olympus BX-51，日本）；超纯水系统（美国Millipore公司）；超低温冰箱-80 ℃（Thermo，美国Thermo公司）。
1.1.3 试剂。二甲苯，乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%），磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，氯化钾，氯化钙，氯化钠，吐温20，胰蛋白酶，山羊血清，3%H2O2，甲醇等为国产分析纯。一抗（兔抗），二抗（山羊抗兔），来自Santa cruz公司；兔抗山羊SABC试剂盒，苏木精，DAB显色试剂来自博士德。
1.1.4 溶液配制
1.1.4.1 免疫组化稀释比。用1倍PBS液稀释一抗（1∶200），血清（1∶10），二抗（1∶100），SABC（1∶100）；DAB试剂用超纯水稀释（1∶20）；试剂A、B、C各50 μL，1 mL超纯水。
1.1.4.2 配制PBS洗涤液。
配制5倍PBS液：氯化钾1 g、磷酸氢二钠14.5 g、磷酸二氢钾1.35 g、氯化钠40 g，1 000 mL蒸馏水；配制1倍PBS液：500 mL的5倍PBS液，2 000 mL蒸馏水。另外加吐温的PBS液再加750 μL吐温混匀即可。
1.1.4.3 配制0.05%胰蛋白酶工作液。
先配制0.5%的胰蛋白酶储藏液：用50 mg胰蛋白酶干粉与10 mL纯水混匀，-20 ℃冰箱保存；再配制1% CaCl2溶液：用0.1 g CaCl2与10 mL纯水混匀，4 ℃冰箱保存；0.05%胰蛋白酶工作液即用1 mL 0.5%胰蛋白酶储藏液加1 mL 1% CaCl2溶液再加8 mL纯水，混匀即可。
1.1.4.4 配制3%过氧化氢液。30% H2O2 40 mL、甲醇360 mL，搅拌混匀即可。
1.2 方法
1.2.1 石蜡组织切片的制作。
收集睾丸、附睾头和附睾尾组织，放入10% 中性福尔马林浸泡2～3 d，修块并置于包埋盒内，再次浸泡在10% 中性福尔马林中3～5 d固定；之后用自来水冲洗12 h，依次在70%、80%、90%、95%、99%、100%乙醇溶液，3个二甲苯溶液，3个蜡缸中进行组织脱水透蜡，再进行石蜡包埋；之后进行石蜡切片，切片厚度为4 μm，每个日龄公羊睾丸、附睾头和附睾尾3个组织，各切3张片子，切片后用纸条将切片放入45 ℃水中使其充分展开，再用载玻片接触切片使其贴片，然后放于50 ℃热台烘干，45 ℃烘片48 h。
1.2.2 脱蜡。
把切片放在载玻片架内，放入二甲苯中连续透明处理2次，各脱蜡1 min；脱蜡后，把切片依次放入不同浓度的乙醇（100%、99%、95%、90%、80%、70%）溶液中，各30 s，脱蜡。脱蜡完成后放到烧杯中，在缓慢又小的自来水流下冲洗10 min。
1.2.3 抗原修复。
酶消化法：用0.05%胰蛋白酶工作液修复。在玻片上滴加胰蛋白酶液，覆盖住组织，将玻片放于37～38 ℃的热台上，消化15 min，然后轻轻甩干玻片上残余的胰蛋白酶，将玻片放于玻片架上，流水浸泡5～10 min。
1.2.4 灭活内源性过氧化物酶。将玻片浸泡于3% H2O2液10 min进行内源性过氧化物酶灭活。
1.2.5 滴加血清和一抗孵育。
切片用3% H2O2浸泡过后取出，把切片放到装有PBS洗涤液浸泡3次，每次5 min。取出浸泡的切片，将切片快速地轻放在暗盒里，然后迅速滴加正常山羊血清稀释液，盖住切片上的组织，盖上盖子，室温孵育30 min。
孵育過后，快速地将之前滴加在切片上的血清甩干净（注意此过程禁止用其他任何溶液冲洗，自然甩干即可），然后迅速地滴加一抗（兔抗、阴性对照滴加PBS液）盖住之前血清盖住的切片组织处，放回暗盒里并盖上盖子，放入冰箱（4 ℃）过夜（间隔12～16 h，14 h左右效果最佳）。
1.2.6 二抗孵育。将盒子从冰箱（4 ℃）中拿出，把切片放到载玻片架内，放入烧杯中用PBS洗涤液连续浸泡3次，每次5 min（此处阴性对照要与GnRHR组织样分开漂洗）。漂洗结束后，把切片放入暗盒里，快速滴加二抗（山羊抗兔），淹盖住组织，室温孵育1 h。
1.2.7 滴加SABC。孵育结束后，把所有的切片都放在同一载玻片架内，并放入烧杯中用PBS洗涤液连续浸泡3次，每次5 min。浸泡完成后，将切片放回暗盒内，快速滴加SABC，淹盖住组织，室温孵育1 h。
1.2.8 显色。
从暗盒里取出切片，装在载玻片架内，并依次放入4个烧杯（第1个烧杯1倍PBS溶液加有吐温，第2个无吐温，第3个有吐温，第4个无吐温）中浸泡，每个烧杯中浸泡5 min。浸泡结束后，将切片放回盒内，按照确定好的GnRHR的显色时间，快速滴加DAB进行显色，每次显色2张载玻片。每次显色时间到后，迅速将片子放入装有清水的烧杯中，洗去载玻片上的DAB液，将片子放在载玻片架里并放入烧杯中。所有片子DAB显色完后，放在自来水下缓慢冲洗3 min；接着进行苏木精染色，染色时间为30 s，每次3张载玻片最佳，每次显色时间到后，迅速将片子放入装有清水的烧杯中，洗去多余的苏木精，把片子放在载玻片架里并放入烧杯中。所有片子染色完后，放在自来水下缓慢冲洗5 min。DAB显色时间约为90 s，苏木精染色时间约为30 s。
1.2.9 脱水。
缓慢冲洗结束后，将切片快速地依次放入不同浓度的乙醇（70%、80%、90%、95%、99%、100%）中脱水，且快速地放入装有二甲苯玻璃瓶中连续透明处理2次，每次1 min，最后放到二甲苯的中待封片。 1.2.10 封片。由于二甲苯挥发比较快，封片速度要快，树脂要适量且不要太稀。
1.2.11 图像观察。不同日龄不同组织分别选取2张切片，每张切片选择视野清晰处在显微镜下成像并拍照。根据阴性对照确定特异性标记，采用Image Pro Plus （IPP）6.0软件分析图像[14]，分别测量睾丸、附睾头和附睾尾中有阳性染色的组织区域（AOI）的光密度（OD）[15-16]，根据GnRHR在睾丸、附睾头和附睾尾中的分布及表达量，呈阳性显色记为+（1～3分）；阳性显色明显记为++（4～7分）；阳性显色最强记为+++（8～10分）。
2 结果与分析
2.1 GnRHR在睾丸、附睾组织中的分布 由图1可知，在55、104、300、1 140 d这4个日龄的建昌黑山羊的附睾头、附睾尾中均有GnRHR的表达。在附睾头中，55 d和104 d的GnRHR主要分布在附睾管上皮下层和基质层中；300 d和1 140 d时，GnRHR的表达量明显增加，在上皮层中有少量分布，在上皮下层与基质层中分布较多。附睾尾中，55 d和104 d时的GnRHR主要分布在基质层中；300 d和1 140 d时，GnRHR在上皮细胞层、上皮下层及基质层中均有表达。在睾丸中，支持细胞中的GnRHR分布很少；55 d和104 d时，GnRHR主要分布在间质细胞中；300 d和1 140 d时，GnRHR在间质细胞和生精细胞上均有分布。
2.2 不同日龄阶段建昌黑山羊睾丸、附睾中GnRHR表达水平
根据免疫组化评分，将染色结果定为3个等级。GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾中的表达情况见表1。
试验结果显示：在睾丸中，55 d时，间质细胞染色程度较浅，但在104、300、1 140 d时，阳性显色程度逐渐增加，在1 140 d时阳性显色最强，GnRHR呈高水平表达；而支持细胞和生精细胞在55 d和104 d时几乎未表达，支持细胞在300、1 140 d时表达很弱，生精细胞在300 d和1 140 d时表达水平相同，阳性显色明显。附睾中，附睾头和附睾尾上皮层GnRHR在55、104 d时均未表达，在300、1 140 d时表达较弱；从55 d到1 140 d，附睾头上皮下层和基质层中的表达量由低到高，在1 140 d时阳性显色最强；附睾尾上皮下层在300 d和1 140 d时表达量较高，而基质层在104、300、1 140 d的表达量相同。以上结果表明，阳性表达部位主要是在睾丸的间质细胞和生精细胞以及附睾的上皮下层和基质层。另外，GnRHR免疫反应产物随日龄的增加呈阳性表达的量也随之增加，且在1 140日龄表达量达到最高。
3 讨论与结论
此次免疫组化试验中，发现GnRHR在建昌黑山羊的睾丸和附睾中都有分布，但不同日龄阶段表达量有一定差异，且呈现由低到高的现象。
促性腺激素释放激素受体（GnRHR）是GnRH对动物体的生物效应介导者，在体内广泛分布。研究发现，在垂体促性腺激素分泌细胞的细胞膜上存在着相对分子质量约100 kD的GnRHR受体[17]，此次试验在睾丸、附睾中也发现其受体的存在。GnRHR属GnRH结合蛋白偶联体系的家族成员[18]，且GnRH本身及性甾体激素、抑制素、激活素等都对GnRHR的表达具有调节作用[19]，而动物体内的激素分泌同样与其生长发育程度有关。通过免疫组化染色试验，可以发现在55 d时，睾丸、附睾中的GnRHR表达量很低甚至没有表达，可能是由于山羊处于发育初期，体内激素分泌并不旺盛；104 d时，在睾丸间质细胞与附睾的上皮下层和基质层中，发现其阳性显色明显，表明山羊此期处于性腺的发育阶段，而GnRHR可能对山羊的生殖系统发育有促进作用，促进性腺的成熟；在300 d和1 140 d时，GnRHR的表达量明显增加，尤其是在睪丸的间质细胞、生精细胞以及附睾的上皮下层、基质层中表达量加强，可能是由于山羊已达到配种繁殖年龄，其生殖器官发育成熟，并具有生精能力，GnRHR在此时可能起到了促进精子成熟及促进精子运动的作用。在55、104、300、1 140 d这4个日龄的雄山羊睾丸、附睾组织结构中，GnRHR在1 140日龄时表达量最高。山羊的繁殖年限一般为8年左右，在3～6岁达到最佳繁殖年龄[20]。由于试验所选用的组织最大日龄限于1 140日龄，正好在山羊的3岁左右，由此可以判断，此时山羊繁殖能力强，促性腺激素释放激素分泌较为旺盛，可能与其受体结合程度也较高。
综上所述，GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾中均有表达，而且不同日龄阶段表达存在组织特异性。
参考文献
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