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【摘要】 目的：建立五花解毒颗粒微生物限度检查方法。方法：对样品进行5种试验菌株的回收率试验及控制菌检查法的验证来确定适宜的检查方法。结果：各试验菌的回收比值在0.5～2之间，控制菌检查中试验组可检出试验菌。结论：可采用常规法进行五花解毒颗粒的微生物限度检查。
【关键词】 微生物限度检查;常规法;方法验证
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.016
Methodology Validation of Microbial Limit Test of
Wuhua Jiedu Grain
XIE Ning，CAI Ni-na
（Nanning Hospital Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）
Abstract： Objective： To establish a method of microbial limit test of Wuhua Jiedu grain. Methods： The recovery tests of 5 bacterial strains and the me thodological validation of control bacteria examination method were done referring to the microbial limit test methods.Results： The recovery of the strain rate was 0.5～2，the experimental group were verified by test bacteria in the control bacteria detection. Conclusion： The Routine Method can be applied to the microbial limit test of Wuhua Jiedu Grain.
Key words： microbial limit test;routine method;method validation
五花解毒顆粒为固体口服制剂，处方含木棉花、金银花、菊花、槐花、葛花，具有清热解毒，凉血止痢的功效。根据《中国药典》四部通则相关规定，本品需检测需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，不得检出大肠埃希菌。经方法学验证，本品的微生物限度检查方法符合规定，方法可行。
1 实验用品
1.1 菌种名称及来源
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，均购于中国食品药品检定研究院。
1.2 样品
五花解毒颗粒批号：180425、180427、180509。生产厂家：南宁市中医医院。
1.3 稀释剂及培养基
稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基。均购于北京三药科技开发公司。
1.4 仪器
立式压力蒸气灭菌锅（LDZX-30FBS）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9246A）、洁净工作台（SW-CJ-2FD）、生物安全柜（11231 BBC 86）、微机生化培养箱（SPX-15OB-Ⅱ）、生化培养箱（SPX-200-Ⅱ）、电热恒温培养箱（DHP-360）等。
2 计数方法的验证
2.1 菌液制备
用0.9%氯化钠溶液将枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的新鲜培养物制成适宜浓度的菌悬液，备用;用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉孢子悬液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
2.2 供试液的制备
1）取供试品10 g，用稀释剂加至50 mL，制成1∶5的供试液。
2）取供试品10 g，用稀释剂加至100 mL，制成1∶10的供试液。
2.3 验证试验方法
试验组：取2.2中2）项下1∶10供试液5份，每份9.9 mL，分别加入0.1 mL的各试验菌液，混匀，使含菌量不大于100 cfu/1 mL，取1 mL注皿，倾注相应的培养基，需氧菌置30～35 ℃培养3天，霉菌置20～25 ℃培养5天。
阳性组：取稀释液代替供试液，方法同试验组。
供试品组：取供试液，以稀释液代替菌液，方法同试验组。
2.4 方法的确定
经查询，部分处方药味对铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用，用铜绿假单胞菌进行预试验，结果见表1。
结果表明，供试液浓度为1∶5时，铜绿假单胞菌的回收比值小于0.5，供试液稀释到1∶5浓度时未能消除样品的抑菌性，方法不可行。供试液浓度为1∶10时，铜绿假单胞菌的回收比值达到要求，取供试液浓度1∶10以平皿法-倾注法测定五花解毒颗粒需氧菌总数应可行。
2.5 计数方法的验证试验
取三批次五花解毒颗粒按2.2中2）项下制备供试液，按2.3验证试验方法进行加菌回收，结果见表2。
结果表明，以常规法进行试验，五个试验菌的回收比值均在0.5～2之间，符合药典规定。
五花解毒颗粒的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法确定为制成1∶10供试液的常规法。 3 控制菌检查方法的验证
菌液制备同2.1。供试液制备同2.2中2）。
1）试验组：取10 mL的1∶10供试液，直接接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基，加入大肠埃希菌（不大于100 cfu），30～35 ℃培养18小时。取1 mL培养物接种至100 mL麦康凯液体培养基，42～44 ℃培养24小时，用接种环沾取培养物，在麦康凯琼脂平板上划线接种，30～35 ℃培养18小时。
2）阳性组：取大肠埃希菌（不大于100 cfu）接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同试验组操作。
3）陰性组：以稀释液代替供试品液，接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同试验组操作。
试验结果见表3。
结果表明，取规定量样品接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查，可检出所加大肠埃希菌。
4 讨论
为保证微生物限度检查方法的科学性和检查结果的准确性，中国药典规定药品的微生物限度检查方法需通过方法适用性试验加以验证，从而真实反映药品的质量。2010年版《中国药典》微生物计数中明确要求进行三次独立的平行试验进行方法验证，2015年版《中国药典》微生物计数法未对试验次数提出具体要求。参照2010年版要求，无论是采用一批样品进行3次试验，还是采用3批样品各进行一次试验，其目的都是为了说明操作中样品的抑菌性是否存在消除不彻底的现象，保证方法的重现性。通过对三批样品的方法验证，可采用常规法对五花解毒颗粒进行需氧菌、霉菌和酵母菌的计数及控制菌检查。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：140-149.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知（中药饮片卷）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：237.
[3] 国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017：568-569.
【作者简介】
谢宁（1980-），女，学士，研究方向为制剂检验和质量标准。
【关键词】 微生物限度检查;常规法;方法验证
【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.016
Methodology Validation of Microbial Limit Test of
Wuhua Jiedu Grain
XIE Ning，CAI Ni-na
（Nanning Hospital Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）
Abstract： Objective： To establish a method of microbial limit test of Wuhua Jiedu grain. Methods： The recovery tests of 5 bacterial strains and the me thodological validation of control bacteria examination method were done referring to the microbial limit test methods.Results： The recovery of the strain rate was 0.5～2，the experimental group were verified by test bacteria in the control bacteria detection. Conclusion： The Routine Method can be applied to the microbial limit test of Wuhua Jiedu Grain.
Key words： microbial limit test;routine method;method validation
五花解毒顆粒为固体口服制剂，处方含木棉花、金银花、菊花、槐花、葛花，具有清热解毒，凉血止痢的功效。根据《中国药典》四部通则相关规定，本品需检测需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，不得检出大肠埃希菌。经方法学验证，本品的微生物限度检查方法符合规定，方法可行。
1 实验用品
1.1 菌种名称及来源
金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]，均购于中国食品药品检定研究院。
1.2 样品
五花解毒颗粒批号：180425、180427、180509。生产厂家：南宁市中医医院。
1.3 稀释剂及培养基
稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基。均购于北京三药科技开发公司。
1.4 仪器
立式压力蒸气灭菌锅（LDZX-30FBS）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9246A）、洁净工作台（SW-CJ-2FD）、生物安全柜（11231 BBC 86）、微机生化培养箱（SPX-15OB-Ⅱ）、生化培养箱（SPX-200-Ⅱ）、电热恒温培养箱（DHP-360）等。
2 计数方法的验证
2.1 菌液制备
用0.9%氯化钠溶液将枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的新鲜培养物制成适宜浓度的菌悬液，备用;用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉孢子悬液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
2.2 供试液的制备
1）取供试品10 g，用稀释剂加至50 mL，制成1∶5的供试液。
2）取供试品10 g，用稀释剂加至100 mL，制成1∶10的供试液。
2.3 验证试验方法
试验组：取2.2中2）项下1∶10供试液5份，每份9.9 mL，分别加入0.1 mL的各试验菌液，混匀，使含菌量不大于100 cfu/1 mL，取1 mL注皿，倾注相应的培养基，需氧菌置30～35 ℃培养3天，霉菌置20～25 ℃培养5天。
阳性组：取稀释液代替供试液，方法同试验组。
供试品组：取供试液，以稀释液代替菌液，方法同试验组。
2.4 方法的确定
经查询，部分处方药味对铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用，用铜绿假单胞菌进行预试验，结果见表1。
结果表明，供试液浓度为1∶5时，铜绿假单胞菌的回收比值小于0.5，供试液稀释到1∶5浓度时未能消除样品的抑菌性，方法不可行。供试液浓度为1∶10时，铜绿假单胞菌的回收比值达到要求，取供试液浓度1∶10以平皿法-倾注法测定五花解毒颗粒需氧菌总数应可行。
2.5 计数方法的验证试验
取三批次五花解毒颗粒按2.2中2）项下制备供试液，按2.3验证试验方法进行加菌回收，结果见表2。
结果表明，以常规法进行试验，五个试验菌的回收比值均在0.5～2之间，符合药典规定。
五花解毒颗粒的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法确定为制成1∶10供试液的常规法。 3 控制菌检查方法的验证
菌液制备同2.1。供试液制备同2.2中2）。
1）试验组：取10 mL的1∶10供试液，直接接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基，加入大肠埃希菌（不大于100 cfu），30～35 ℃培养18小时。取1 mL培养物接种至100 mL麦康凯液体培养基，42～44 ℃培养24小时，用接种环沾取培养物，在麦康凯琼脂平板上划线接种，30～35 ℃培养18小时。
2）阳性组：取大肠埃希菌（不大于100 cfu）接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同试验组操作。
3）陰性组：以稀释液代替供试品液，接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同试验组操作。
试验结果见表3。
结果表明，取规定量样品接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查，可检出所加大肠埃希菌。
4 讨论
为保证微生物限度检查方法的科学性和检查结果的准确性，中国药典规定药品的微生物限度检查方法需通过方法适用性试验加以验证，从而真实反映药品的质量。2010年版《中国药典》微生物计数中明确要求进行三次独立的平行试验进行方法验证，2015年版《中国药典》微生物计数法未对试验次数提出具体要求。参照2010年版要求，无论是采用一批样品进行3次试验，还是采用3批样品各进行一次试验，其目的都是为了说明操作中样品的抑菌性是否存在消除不彻底的现象，保证方法的重现性。通过对三批样品的方法验证，可采用常规法对五花解毒颗粒进行需氧菌、霉菌和酵母菌的计数及控制菌检查。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：140-149.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知（中药饮片卷）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：237.
[3] 国家药典委员会.中国药典分析检测技术指南[M].北京：中国医药科技出版社，2017：568-569.
【作者简介】
谢宁（1980-），女，学士，研究方向为制剂检验和质量标准。