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摘要
本文利用环介导等温扩增技术（ loopmediated isothermal amplification，LAMP），针对西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli） 基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物AcF3/AcB3和AcFIP /AcBIP，建立了西瓜嗜酸菌的LAMP 检测体系。利用该体系在65℃保温1 h，通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强，其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
关键词
环介导等温扩增技术；瓜类细菌性果斑病菌；检测
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.020
Abstract
The loopmediated isothermal amplification （LAMP） was established for rapid detection of Acidovorax citrulli.Four primers， AcF3/AcB3 and AcFIP /AcBIP， were designed specifically to recognize the Aave_4063 and Aave_4064 genes of A. citrulli. The LAMP products was obtained under isothermal conditions at 65 ℃ for 1 h. The result showed that no amplicon was observed except A. citrulli strains. The detection limits of pure cultures were 2.0×101 cfu/mL. This LAMP detection system provides a new alternative method for the rapid detection of A. citrulli.
Key words
loopmediated isothermal amplification （LAMP）；Acidovorax citrulli；detection
瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是西甜瓜等葫芦科作物上重要的细菌病害，由西瓜嗜酸菌 （Acidovorax citrulli）引起[12]。该病为典型的种传病害，其病原菌可侵染叶片、果实和种子，严重影响果实的品质和产量，对瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁[3]。瓜类细菌性果斑病自20世纪90年代在我国首次报道以来，在新疆、海南、内蒙古、宁夏、北京、河北、山东、吉林、福建、湖南等地相继发生，并呈上升趋势，造成大田西瓜和甜瓜减产甚至绝收，给西甜瓜生产带来巨大损失[49]。在病害发病初期快速、准确鉴定出BFB，及时实施有效的药剂防控措施，对防治该病害的扩散和蔓延尤为重要。因此，建立西瓜嗜酸菌的快速、准确、便捷的检测技术是防止该病害发生的重要举措。
目前检测西瓜嗜酸菌的主要方法有：传统的细菌学分离方法[10]、Biolog鉴定方法[11]、血清学检测方法[12]和分子生物学方法[1316]，但这些诊断方法存在诊断过程繁琐、周期长、成本高、灵敏度不高或特异性不强等特点，同时还需要昂贵的仪器和试剂等。2000年Notomi等人[17]报道了一种新型核酸扩增技术—环介导等温扩增法（loopmediated isothermal amplification，LAMP），该方法根据目的基因及其特点，针对靶序列的6个特异性区域设计两对引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下（60～65 ℃）保温30～60 min，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生[17]。该检测方法具有特异性好、灵敏度高、反应时间短、操作方便和不需要昂贵的仪器等优点，目前已被广泛应用于病毒、细菌、原生动物和真菌等领域的检测中[1821]。
本试验根据A.citrulli基因组中Aave_4063和Aave_4064序列的特点，基于LAMP技术建立了瓜类细菌性果斑病菌的快速恒温扩增检测体系，并将其应用于市售的瓜种子实际样品检测中。
1材料与方法
1.1材料
Bst DNA 聚合酶购自New England Biolabs（NEB）公司； 甜菜碱、MgSO4、钙黄绿素（calcein）购自Sigma公司；dNTPs、DL100 marker 等购自宝生物工程（大连） 有限公司； Loopamp反应管购自日本荣研化学株式会社；移液管购自AXYGEN 公司； 电热恒温水浴锅（DK8D） 购自上海森信实验仪器有限公司； 细菌基因组DNA提取试剂盒（天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒）购自天根（北京）公司。供试菌株寄主、来源及数量见2.2小节。
1.2引物设计
根据Aave_4063和Aave_4064序列，应用Bioedit软件进行序列分析，并使用PrimerExplore v 4 软件，依据LAMP引物的设计原则，设计LAMP引物。探针由宝生物工程 （大连） 有限公司合成，用ddH2O 溶解后分装，-20 ℃冰箱保存备用。
1.3LAMP反应体系的建立
LAMP检测反应体系为25 μL，包括2.5 μL 10×ThermoPol[200 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L （NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Trition X100，pH 8.8]、8 mmol/L MgSO4、0.8 mol/L甜菜碱、500 μmol/L each dNTP、0.4 μmol/L外引物AcF3 和 AcB3、1.6 μmol/L的内引物AcFIP和 AcBIP、1 μL Bst DNA聚合酶（8 U/μL）、1 μL 0.02 mmol/L钙黄绿素染料，1 μL DNA模板或菌悬液，加ddH2O补至25 μL。将反应管置于水浴锅65 ℃恒温反应 60 min，然后80 ℃加热5 min使酶失活终止反应。 1.4LAMP扩增产物判断方法
LAMP扩增产物可通过肉眼观察浑浊度的变化来判断，也可通过加入荧光染料观察颜色变化来判断。本试验在反应前加入1 μL 0.02 mmol/L的钙黄绿素染料，产生扩增的反应管颜色由橙色变为亮绿色，未产生扩增的则仍保持橙色不变，阴性对照也为橙色。
1.5LAMP特异性检测
按照天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒说明书，分别提取供试菌株的基因组DNA，进行LAMP扩增，鉴定LAMP反应的特异性。
1.6LAMP灵敏度检测
果斑病菌菌株xjl12的基因组DNA模板经测定浓度后，按10倍梯度稀释为2.0×106～2.0×100cfu/mL。分别取1 μL作为LAMP反应模板，每个梯度3个重复。反应结束后，鉴别是否发生了LAMP扩增，确定LAMP的灵敏度，并与常规PCR[22]的灵敏度进行比较。
1.7实际样品检测
选取6种市售种子进行检测。每份种子取300粒，剖开后，加50 mL无菌水室温浸泡4 h，将浸出液6 000 r/min离心3 min，弃上清。加入2 mL无菌水重新悬浮沉淀，取0.5 mL 悬浮液用于分离培养，剩余的1.5 mL悬浮液利用天根细菌DNA提取试剂盒提取DNA，取1 μL DNA作为LAMP检测的模板。
在进行实际样品检测时，所有的样品均利用果斑病菌半选择性培养基TWZ（0.5%蛋白胨， 0.025% CaCl2， 1%吐温80， 50 mg/L小檗碱， 50 mg/L放线菌酮， 50 mg/L TTC）进行分离培养，培养条件为28 ℃，24～48 h，用以验证LAMP检测结果的可靠性。
2结果与分析
2.1LAMP检测的特异性引物
本试验所选取的靶标基因为Aave_4063和Aave_4064，基因序列信息均来自于GenBank （登录号为NC_008752： 4516230～4516461）。笔者将缺失的Aave_4063和Aave_4064基因中的一段（区域：45162304516461）核酸序列在NCBI 中进行BLASTn和tBLASTx搜索，结果发现没有任何已知序列与其相同。本研究根据Aave_4063和Aave_4064基因序列设计了1 套果斑病菌LAMP检测的特异性引物（表1）。其中AcF3 / AcB3 为外引物，AcFIP / AcBIP 为内引物。
2.2LAMP检测方法的特异性
以本研究设计的特异性引物对果斑病菌进行LAMP扩增，以水作为阴性对照，并用其他嗜酸菌属菌悬液作为病原菌对照检测LAMP反应的特异性。结果如图1所示，果斑病菌反应管呈亮绿色，为阳性，其他嗜酸菌和阴性对照均为黄绿色，为阴性。同样的，利用本试验所建立的LAMP体系，其他参试菌株也均为阴性（表2）。
2.3LAMP检测方法的灵敏度
将10 倍梯度稀释的果斑病菌悬液进行LAMP扩增。结果如图2～3所示，检测结果的最低检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL，比常规PCR检测方法高100倍。
2.4实际样品检测结果
利用本试验建立的瓜类细菌性果斑病菌LAMP检测体系，对市售的西、甜瓜种子进行了检测。结果如图4所示：1～5反应管呈亮绿色，为阳性，6～7反应管呈现黄绿色，为阴性，且所有LAMP检测结果与半选择性培养基结果一致（结果未列出）。结果表明本研究所建立的检测方法可用于实际样品的检测。
3讨论
西瓜嗜酸菌引起的瓜类细菌性果斑病为种传病害，种子带菌是其发生的主要原因[23]。近期研究表明，在温室育苗的条件下，单粒种子仅携带10 cfu的西瓜嗜酸菌就可以导致瓜类细菌性果斑病的大面积发生和流行[24]。至今对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，控制其传播扩散是预防此病害最有效的措施。目前，WFB1/WFB2是西瓜嗜酸菌PCR检测常用的引物之一，由于西瓜嗜酸菌与燕麦嗜酸菌（A.avenae，GenBank： NC_015138）亲缘关系非常接近，所以常常导致检测引物无法区分这两个种[22]。而本试验通过生物信息学分析选取的靶标基因为Aave_4063和Aave_4064，将Aave_4064序列在NCBI 中进行BLASTn和tBLASTx比对，结果没有任何已知序列与其相同，在燕麦嗜酸菌基因组中也未发现其同源序列，从而保证了检测的特异性。利用本文建立基于LAMP的西瓜嗜酸菌检测体系，对不同寄主上分离到的西瓜嗜酸菌菌株和其他17个参试菌株进行检测，结果表明，该体系能特异地扩增出西瓜嗜酸菌，能有效区分开与其亲缘关系较近的菌株，例如燕麦嗜酸菌（A.avenae）、卡特莱兰嗜酸菌（A.cattleyae）、敏捷嗜酸菌（A.facilis）、魔芋嗜酸菌（A.konjaci）及假单胞菌属（Pseudomonas）细菌。证明本研究所设计的LAMP检测引物种内保守、种间特异。在灵敏度试验中，常规PCR的检测灵敏度为2.0×103cfu/mL，而该体系的最低检测灵敏度为2.0×101cfu/mL，比常规PCR的灵敏度高出100倍。
本研究建立的LAMP检测体系在等温条件下（65 ℃）就能进行扩增反应，同时反应时间短，仅需1 h，不需要热循环仪，一个普通水浴锅就可进行，这是常规的PCR检测不能达到的。在结果判定时，本研究采用加入荧光染料钙黄绿素，产生扩增的反应管颜色由橙色变为亮绿色，未产生扩增的则保持橙色不变，该方法既提高了对检测结果的肉眼识别率，又可直接用于瓜类细菌性果斑病的现场诊断，大大提高了检测效率。在利用本研究建立的LAMP检测体系从瓜种子中检测西瓜嗜酸菌时，包括种子处理的时间在内，共需8 h。一般来说，利用半选择性培养基进行病原菌分离和幼苗生长测定法是西、甜瓜种子带菌检测的常用方法，一般需要3～8 d。所以本研究建立的检测体系与常规方法相比省时、省力、省钱。 LAMP技术在实际应用中表现出特异性强、灵敏度高、速度快、操作方便等特点，为检疫性有害生物检测提供了有力的技术支持，对早期检疫性有害生物准确诊断具有重要意义。本研究首次建立了对西瓜嗜酸菌检测的可视化LAMP方法，该方法简单易行，对仪器设备和检测人员的技能要求不是十分苛刻，其特异性、灵敏度及快速检测方面均能够满足口岸检疫和农业生产单位对检疫性有害生物的快速诊断需要，可推广应用于西、甜瓜种苗的健康检测中。
参考文献
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本文利用环介导等温扩增技术（ loopmediated isothermal amplification，LAMP），针对西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli） 基因组中Aave_4063和Aave_4064序列设计了2对特异引物AcF3/AcB3和AcFIP /AcBIP，建立了西瓜嗜酸菌的LAMP 检测体系。利用该体系在65℃保温1 h，通过荧光显色即可完成检测。设计的引物特异性强，其检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。
关键词
环介导等温扩增技术；瓜类细菌性果斑病菌；检测
中图分类号：
S 436.5
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.020
Abstract
The loopmediated isothermal amplification （LAMP） was established for rapid detection of Acidovorax citrulli.Four primers， AcF3/AcB3 and AcFIP /AcBIP， were designed specifically to recognize the Aave_4063 and Aave_4064 genes of A. citrulli. The LAMP products was obtained under isothermal conditions at 65 ℃ for 1 h. The result showed that no amplicon was observed except A. citrulli strains. The detection limits of pure cultures were 2.0×101 cfu/mL. This LAMP detection system provides a new alternative method for the rapid detection of A. citrulli.
Key words
loopmediated isothermal amplification （LAMP）；Acidovorax citrulli；detection
瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是西甜瓜等葫芦科作物上重要的细菌病害，由西瓜嗜酸菌 （Acidovorax citrulli）引起[12]。该病为典型的种传病害，其病原菌可侵染叶片、果实和种子，严重影响果实的品质和产量，对瓜类生产及相关产业构成了极大的威胁[3]。瓜类细菌性果斑病自20世纪90年代在我国首次报道以来，在新疆、海南、内蒙古、宁夏、北京、河北、山东、吉林、福建、湖南等地相继发生，并呈上升趋势，造成大田西瓜和甜瓜减产甚至绝收，给西甜瓜生产带来巨大损失[49]。在病害发病初期快速、准确鉴定出BFB，及时实施有效的药剂防控措施，对防治该病害的扩散和蔓延尤为重要。因此，建立西瓜嗜酸菌的快速、准确、便捷的检测技术是防止该病害发生的重要举措。
目前检测西瓜嗜酸菌的主要方法有：传统的细菌学分离方法[10]、Biolog鉴定方法[11]、血清学检测方法[12]和分子生物学方法[1316]，但这些诊断方法存在诊断过程繁琐、周期长、成本高、灵敏度不高或特异性不强等特点，同时还需要昂贵的仪器和试剂等。2000年Notomi等人[17]报道了一种新型核酸扩增技术—环介导等温扩增法（loopmediated isothermal amplification，LAMP），该方法根据目的基因及其特点，针对靶序列的6个特异性区域设计两对引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下（60～65 ℃）保温30～60 min，即可实现核酸的大量扩增，并且伴有肉眼可见的副产物白色焦磷酸酶沉淀产生[17]。该检测方法具有特异性好、灵敏度高、反应时间短、操作方便和不需要昂贵的仪器等优点，目前已被广泛应用于病毒、细菌、原生动物和真菌等领域的检测中[1821]。
本试验根据A.citrulli基因组中Aave_4063和Aave_4064序列的特点，基于LAMP技术建立了瓜类细菌性果斑病菌的快速恒温扩增检测体系，并将其应用于市售的瓜种子实际样品检测中。
1材料与方法
1.1材料
Bst DNA 聚合酶购自New England Biolabs（NEB）公司； 甜菜碱、MgSO4、钙黄绿素（calcein）购自Sigma公司；dNTPs、DL100 marker 等购自宝生物工程（大连） 有限公司； Loopamp反应管购自日本荣研化学株式会社；移液管购自AXYGEN 公司； 电热恒温水浴锅（DK8D） 购自上海森信实验仪器有限公司； 细菌基因组DNA提取试剂盒（天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒）购自天根（北京）公司。供试菌株寄主、来源及数量见2.2小节。
1.2引物设计
根据Aave_4063和Aave_4064序列，应用Bioedit软件进行序列分析，并使用PrimerExplore v 4 软件，依据LAMP引物的设计原则，设计LAMP引物。探针由宝生物工程 （大连） 有限公司合成，用ddH2O 溶解后分装，-20 ℃冰箱保存备用。
1.3LAMP反应体系的建立
LAMP检测反应体系为25 μL，包括2.5 μL 10×ThermoPol[200 mmol/L TrisHCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L （NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1% Trition X100，pH 8.8]、8 mmol/L MgSO4、0.8 mol/L甜菜碱、500 μmol/L each dNTP、0.4 μmol/L外引物AcF3 和 AcB3、1.6 μmol/L的内引物AcFIP和 AcBIP、1 μL Bst DNA聚合酶（8 U/μL）、1 μL 0.02 mmol/L钙黄绿素染料，1 μL DNA模板或菌悬液，加ddH2O补至25 μL。将反应管置于水浴锅65 ℃恒温反应 60 min，然后80 ℃加热5 min使酶失活终止反应。 1.4LAMP扩增产物判断方法
LAMP扩增产物可通过肉眼观察浑浊度的变化来判断，也可通过加入荧光染料观察颜色变化来判断。本试验在反应前加入1 μL 0.02 mmol/L的钙黄绿素染料，产生扩增的反应管颜色由橙色变为亮绿色，未产生扩增的则仍保持橙色不变，阴性对照也为橙色。
1.5LAMP特异性检测
按照天根细菌基因组DNA小量制备试剂盒说明书，分别提取供试菌株的基因组DNA，进行LAMP扩增，鉴定LAMP反应的特异性。
1.6LAMP灵敏度检测
果斑病菌菌株xjl12的基因组DNA模板经测定浓度后，按10倍梯度稀释为2.0×106～2.0×100cfu/mL。分别取1 μL作为LAMP反应模板，每个梯度3个重复。反应结束后，鉴别是否发生了LAMP扩增，确定LAMP的灵敏度，并与常规PCR[22]的灵敏度进行比较。
1.7实际样品检测
选取6种市售种子进行检测。每份种子取300粒，剖开后，加50 mL无菌水室温浸泡4 h，将浸出液6 000 r/min离心3 min，弃上清。加入2 mL无菌水重新悬浮沉淀，取0.5 mL 悬浮液用于分离培养，剩余的1.5 mL悬浮液利用天根细菌DNA提取试剂盒提取DNA，取1 μL DNA作为LAMP检测的模板。
在进行实际样品检测时，所有的样品均利用果斑病菌半选择性培养基TWZ（0.5%蛋白胨， 0.025% CaCl2， 1%吐温80， 50 mg/L小檗碱， 50 mg/L放线菌酮， 50 mg/L TTC）进行分离培养，培养条件为28 ℃，24～48 h，用以验证LAMP检测结果的可靠性。
2结果与分析
2.1LAMP检测的特异性引物
本试验所选取的靶标基因为Aave_4063和Aave_4064，基因序列信息均来自于GenBank （登录号为NC_008752： 4516230～4516461）。笔者将缺失的Aave_4063和Aave_4064基因中的一段（区域：45162304516461）核酸序列在NCBI 中进行BLASTn和tBLASTx搜索，结果发现没有任何已知序列与其相同。本研究根据Aave_4063和Aave_4064基因序列设计了1 套果斑病菌LAMP检测的特异性引物（表1）。其中AcF3 / AcB3 为外引物，AcFIP / AcBIP 为内引物。
2.2LAMP检测方法的特异性
以本研究设计的特异性引物对果斑病菌进行LAMP扩增，以水作为阴性对照，并用其他嗜酸菌属菌悬液作为病原菌对照检测LAMP反应的特异性。结果如图1所示，果斑病菌反应管呈亮绿色，为阳性，其他嗜酸菌和阴性对照均为黄绿色，为阴性。同样的，利用本试验所建立的LAMP体系，其他参试菌株也均为阴性（表2）。
2.3LAMP检测方法的灵敏度
将10 倍梯度稀释的果斑病菌悬液进行LAMP扩增。结果如图2～3所示，检测结果的最低检测灵敏度为2.0×101 cfu/mL，比常规PCR检测方法高100倍。
2.4实际样品检测结果
利用本试验建立的瓜类细菌性果斑病菌LAMP检测体系，对市售的西、甜瓜种子进行了检测。结果如图4所示：1～5反应管呈亮绿色，为阳性，6～7反应管呈现黄绿色，为阴性，且所有LAMP检测结果与半选择性培养基结果一致（结果未列出）。结果表明本研究所建立的检测方法可用于实际样品的检测。
3讨论
西瓜嗜酸菌引起的瓜类细菌性果斑病为种传病害，种子带菌是其发生的主要原因[23]。近期研究表明，在温室育苗的条件下，单粒种子仅携带10 cfu的西瓜嗜酸菌就可以导致瓜类细菌性果斑病的大面积发生和流行[24]。至今对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，控制其传播扩散是预防此病害最有效的措施。目前，WFB1/WFB2是西瓜嗜酸菌PCR检测常用的引物之一，由于西瓜嗜酸菌与燕麦嗜酸菌（A.avenae，GenBank： NC_015138）亲缘关系非常接近，所以常常导致检测引物无法区分这两个种[22]。而本试验通过生物信息学分析选取的靶标基因为Aave_4063和Aave_4064，将Aave_4064序列在NCBI 中进行BLASTn和tBLASTx比对，结果没有任何已知序列与其相同，在燕麦嗜酸菌基因组中也未发现其同源序列，从而保证了检测的特异性。利用本文建立基于LAMP的西瓜嗜酸菌检测体系，对不同寄主上分离到的西瓜嗜酸菌菌株和其他17个参试菌株进行检测，结果表明，该体系能特异地扩增出西瓜嗜酸菌，能有效区分开与其亲缘关系较近的菌株，例如燕麦嗜酸菌（A.avenae）、卡特莱兰嗜酸菌（A.cattleyae）、敏捷嗜酸菌（A.facilis）、魔芋嗜酸菌（A.konjaci）及假单胞菌属（Pseudomonas）细菌。证明本研究所设计的LAMP检测引物种内保守、种间特异。在灵敏度试验中，常规PCR的检测灵敏度为2.0×103cfu/mL，而该体系的最低检测灵敏度为2.0×101cfu/mL，比常规PCR的灵敏度高出100倍。
本研究建立的LAMP检测体系在等温条件下（65 ℃）就能进行扩增反应，同时反应时间短，仅需1 h，不需要热循环仪，一个普通水浴锅就可进行，这是常规的PCR检测不能达到的。在结果判定时，本研究采用加入荧光染料钙黄绿素，产生扩增的反应管颜色由橙色变为亮绿色，未产生扩增的则保持橙色不变，该方法既提高了对检测结果的肉眼识别率，又可直接用于瓜类细菌性果斑病的现场诊断，大大提高了检测效率。在利用本研究建立的LAMP检测体系从瓜种子中检测西瓜嗜酸菌时，包括种子处理的时间在内，共需8 h。一般来说，利用半选择性培养基进行病原菌分离和幼苗生长测定法是西、甜瓜种子带菌检测的常用方法，一般需要3～8 d。所以本研究建立的检测体系与常规方法相比省时、省力、省钱。 LAMP技术在实际应用中表现出特异性强、灵敏度高、速度快、操作方便等特点，为检疫性有害生物检测提供了有力的技术支持，对早期检疫性有害生物准确诊断具有重要意义。本研究首次建立了对西瓜嗜酸菌检测的可视化LAMP方法，该方法简单易行，对仪器设备和检测人员的技能要求不是十分苛刻，其特异性、灵敏度及快速检测方面均能够满足口岸检疫和农业生产单位对检疫性有害生物的快速诊断需要，可推广应用于西、甜瓜种苗的健康检测中。
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