【摘 要】
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本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达.以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR 扩增获得survivin基因全长序列.P
【机 构】
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福建医科大学附属协和医院,福建泉州市第一医院血液科,陈志哲,福建医科大学分子医学研究中心
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本研究旨在构建含有人存活蛋白(survivin)基因的重组腺病毒载体,并探讨其在转染树突状细胞中的表达.以质粒pcDNA3.0-survivin为模板,通过PCR 扩增获得survivin基因全长序列.PCR产物回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pShuttle- CMV-survivin.通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pShuttle-CMV-survivin 转化E.coli BJ5183 菌(含腺病毒骨架质粒)并进行同源重组,然后筛选阳性克隆,提取质粒,将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染293 细胞.制备病毒上清并测定其滴度,将病毒上清转染树突状细胞,应用Western blot方法分析survivin的表达.结果表明:成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为: 2.65×109pfu/ml.Western blot鉴定显示,经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin.结论:含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功,为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础.
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