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摘要：从制糖厂废液污泥中分离筛选得到具有高絮凝活性的絮凝菌株WSZ03，采用分子生物学结合形态学特征对WSZ03菌株进行鉴定，通过内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）序列分析结合形态学观察确定WSZ03属曲霉属。探讨利用糖蜜乙醇废液对其进行廉价培养及同时处理糖蜜乙醇废液的可行性。结果表明，该菌株培养48 h的菌液适合作为絮凝菌种;WSZ03絮凝菌对糖蜜乙醇废水的最佳絮凝条件如下：接种量2%、培养时间36 h、温度28～34 ℃，pH值6。糖蜜乙醇废水的化学需氧量（chemical oxygen demand，简称COD）去除率达到75.00%，色度去除率为62.50%，浊度去除率为88.89%。
关键词：絮凝菌;糖蜜乙醇废液;廉价培养;絮凝条件
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0261-03
收稿日期：2017-09-12
基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（编号：KY2016LX286）;河池学院校级重点科研课题（编号：XJ2016ZD001）;河池学院校级大学生创新创业计划（编号：SJ2016042）;广西壮族自治区级大学生创新创业计划（编号：201710605096）。
作者简介：李梦茜（1986—），女，河南周口人，硕士，讲师，主要从事微生物天然产物方向的研究。E-mail：limengxi66@126.com。
通信作者：张振旺，博士研究生，主要从事分子生物学方向的研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。 糖蜜乙醇废水是以糖厂制糖副产品糖蜜为原料，在发酵生产乙醇过程中产生的高浓度有机废水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白质、纤维素等有机物，如果直接排放，会造成水体富营养化，其结果是水体黑臭，甚至失去功能，从而严重影响环境[1-2]。目前，该类废水的常规处理方法为生化处理法、化学处理法或多种方法的组合工艺等[3]。微生物絮凝剂（MBF）是利用生物技术，从微生物体或其分泌物中提取纯化而获得的一种天然高分子絮凝剂，该类絮凝剂可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒发生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂。近年来，有不少学者报道了微生物絮凝剂在污水处理中的应用[4-10]，但是由于MBF制备成本高，产量低，生产菌种筛选困难，导致目前微生物絮凝剂多处于实验室研究阶段，在工业上并未得到广泛推广。因此，寻找廉价、高效的微生物絮凝剂生产方法，能有效地推动其广泛应用。
针对上述问题，本研究以糖蜜乙醇废水为培养基主要成分，从糖厂废液污泥中筛选对糖蜜乙醇废水具有絮凝活性的絮凝菌，通过比较废水处理前后的化学需氧量（chemical oxygen demand，简称COD）、浊度、色度的变化，对絮凝菌的最佳絮凝条件进行优化，以得到对糖蜜乙醇废水较理想的处理效果。
1 材料与方法
1.1 菌种来源与培养基
菌种：从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中筛选得到。固体培养基：10倍液糖蜜乙醇废液1 000 mL，琼脂粉20 g，调节pH值为7.0。液体培养基：10倍液糖蜜乙醇废水，调节pH值为7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种分离与筛选 采用稀释涂布法将污泥进行梯度稀释，并涂布在灭菌的平皿培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，用划线法纯化得到单一菌落，将纯菌落接种于装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶中，于28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养48 h得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和初始液体培养基的吸光度，进行絮凝活性的初步分析。
1.2.2 絮凝率的测定 吸取静置20 min的菌株发酵上清液，采用二极管阵列分光光度计，在550 nm处测定吸光度（以D550 nm（B）表示），取稀释10倍的糖蜜乙醇废液，以550 nm处的吸光度（以D550 nm（A）表示）为对照，计算絮凝菌的絮凝率：
絮凝率=（D550 nm（A）-D550 nm（B））/D550 nm（A）×100%。
1.2.3 菌种鉴定 采用平板划线法获得单菌落，观察菌落生长形态，并借助显微镜观察菌丝和孢子形态，以初步鉴定菌属，同时结合基因序列的测定确定菌属，其中基因序列的测定先使用生工生物工程（上海）股份有限公司的DNA提取试剂盒提取目标菌株的基因组DNA，以ITS1 ITS4作为扩增真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）的通用引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，再将所得测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）网站进行BLAST比对分析。
1.2.4 絮凝条件的优化
1.2.4.1 单因素试验 考察接种量、培养时间、培养温度和初始pH值等4個因素对WSZ03絮凝效果的影响。
（1）接种量。将于28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养48 h得到的菌液作为种子液（菌体浓度104 CFU/mL），接入糖蜜乙醇废液装液量为50 mL的250 mL三角瓶中，接种量分别为1%、2%、4%、6%、8%、10%，在摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
（2）培养时间。在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，再接入种子液，接着于28 ℃、80 r/min摇床中分别培养6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。 （3）培养温度：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，接入种子液，接着分别在22、25、28、31、34、37 ℃下 80 r/min 摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
（4）初始pH值：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，利用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分别调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10后接入种子液，接着在28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
1.2.4.2 正交试验 设计接种量、絮凝时间、温度、初始pH值等4个因素的3个水平，考察影响絮凝率的条件，以得出絮凝菌的最佳絮凝条件，因素水平设计见表1。
1.2.5 处理糖蜜乙醇废水 在最佳絮凝条件下，用絮凝菌对糖蜜乙醇废水进行处理，比较处理前后水质的参数变化，衡量水质参数的指标为COD、色度和浊度。
采用COD测定计（型号：A-7325）测量COD，采用浊度仪 （型号：BTCJ-TSS）测量浊度，利用色度计（HI93727色度比色计）测定色度。
2 结果与分析
2.1 絮凝剂产生菌的选择
从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中经初筛、复筛分离纯化得到1株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率为92%，因此选择该菌株用于后续试验。
2.2 絮凝剂产生菌的鉴定
菌种形态学观察及ITS序列的测序鉴定：在固体培养基上于28 ℃培养2 d，可见白色菌丝，3 d开始产生孢子，5 d时孢子成熟。菌落直径约为3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色（图1-a）;孢子呈圆形、灰色（图1-b）。结合ITS测序结果（ITS片段长度为760 bp，图2），初步判断WSZ03菌株属于曲霉属。
2.3 SWZ03的絮凝率曲线
于稀释10倍的糖蜜乙醇废液培养基中接入1%絮凝菌孢子悬液，不同培养时间段对糖蜜乙醇废液的絮凝效果见图3。可以得出，该菌培养在48 h时达到较高的絮凝活性，通过测定菌体湿质量可知，此时菌体的生物量也已经达到最高水平。因此，后续试验均采用培养48 h的菌液作为菌种。
2.4 接种量对WSZ03絮凝效果的影响
采用“1.2.4.1”节中的试验方法，考察接种量、培养时间、培养温度和初始pH值等4个因素对絮凝菌絮凝效果的影响。由图4至图7的单因素絮凝试验结果表明，接种量对絮凝活性的影响不大，当接种量为2%时，絮凝效果明显;当培养时间为36 h时，絮凝率较高;培养温度对絮凝活性的影响亦不明显，31 ℃时的絮凝率较高;当初始pH值为6时，絮凝率较高。
2.5 絮凝条件的正交试验
按照“1.2.4.2”节的试验方法对以上影响絮凝效果的4个因素做4因素3水平正交试验。由表2可知，4个因素极差从小到大的顺序为时间
关键词：絮凝菌;糖蜜乙醇废液;廉价培养;絮凝条件
中图分类号： S182 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）01-0261-03
收稿日期：2017-09-12
基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（编号：KY2016LX286）;河池学院校级重点科研课题（编号：XJ2016ZD001）;河池学院校级大学生创新创业计划（编号：SJ2016042）;广西壮族自治区级大学生创新创业计划（编号：201710605096）。
作者简介：李梦茜（1986—），女，河南周口人，硕士，讲师，主要从事微生物天然产物方向的研究。E-mail：limengxi66@126.com。
通信作者：张振旺，博士研究生，主要从事分子生物学方向的研究。E-mail：zhenwangzhang@126.com。 糖蜜乙醇废水是以糖厂制糖副产品糖蜜为原料，在发酵生产乙醇过程中产生的高浓度有机废水，含有大量碳水化合物、脂肪、蛋白质、纤维素等有机物，如果直接排放，会造成水体富营养化，其结果是水体黑臭，甚至失去功能，从而严重影响环境[1-2]。目前，该类废水的常规处理方法为生化处理法、化学处理法或多种方法的组合工艺等[3]。微生物絮凝剂（MBF）是利用生物技术，从微生物体或其分泌物中提取纯化而获得的一种天然高分子絮凝剂，该类絮凝剂可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒发生凝聚沉降，是具有生物分解性和安全性的高效、无毒、无二次污染的绿色水处理剂。近年来，有不少学者报道了微生物絮凝剂在污水处理中的应用[4-10]，但是由于MBF制备成本高，产量低，生产菌种筛选困难，导致目前微生物絮凝剂多处于实验室研究阶段，在工业上并未得到广泛推广。因此，寻找廉价、高效的微生物絮凝剂生产方法，能有效地推动其广泛应用。
针对上述问题，本研究以糖蜜乙醇废水为培养基主要成分，从糖厂废液污泥中筛选对糖蜜乙醇废水具有絮凝活性的絮凝菌，通过比较废水处理前后的化学需氧量（chemical oxygen demand，简称COD）、浊度、色度的变化，对絮凝菌的最佳絮凝条件进行优化，以得到对糖蜜乙醇废水较理想的处理效果。
1 材料与方法
1.1 菌种来源与培养基
菌种：从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中筛选得到。固体培养基：10倍液糖蜜乙醇废液1 000 mL，琼脂粉20 g，调节pH值为7.0。液体培养基：10倍液糖蜜乙醇废水，调节pH值为7.0。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种分离与筛选 采用稀释涂布法将污泥进行梯度稀释，并涂布在灭菌的平皿培养基上，置于28 ℃恒温培养箱中培养3～5 d，用划线法纯化得到单一菌落，将纯菌落接种于装有50 mL液体培养基的250 mL摇瓶中，于28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养48 h得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和初始液体培养基的吸光度，进行絮凝活性的初步分析。
1.2.2 絮凝率的测定 吸取静置20 min的菌株发酵上清液，采用二极管阵列分光光度计，在550 nm处测定吸光度（以D550 nm（B）表示），取稀释10倍的糖蜜乙醇废液，以550 nm处的吸光度（以D550 nm（A）表示）为对照，计算絮凝菌的絮凝率：
絮凝率=（D550 nm（A）-D550 nm（B））/D550 nm（A）×100%。
1.2.3 菌种鉴定 采用平板划线法获得单菌落，观察菌落生长形态，并借助显微镜观察菌丝和孢子形态，以初步鉴定菌属，同时结合基因序列的测定确定菌属，其中基因序列的测定先使用生工生物工程（上海）股份有限公司的DNA提取试剂盒提取目标菌株的基因组DNA，以ITS1 ITS4作为扩增真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）的通用引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，再将所得测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，简称NCBI）网站进行BLAST比对分析。
1.2.4 絮凝条件的优化
1.2.4.1 单因素试验 考察接种量、培养时间、培养温度和初始pH值等4個因素对WSZ03絮凝效果的影响。
（1）接种量。将于28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养48 h得到的菌液作为种子液（菌体浓度104 CFU/mL），接入糖蜜乙醇废液装液量为50 mL的250 mL三角瓶中，接种量分别为1%、2%、4%、6%、8%、10%，在摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
（2）培养时间。在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，再接入种子液，接着于28 ℃、80 r/min摇床中分别培养6、12、18、24、30、36、42、48 h，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。 （3）培养温度：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，接入种子液，接着分别在22、25、28、31、34、37 ℃下 80 r/min 摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液和发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
（4）初始pH值：在250 mL三角瓶中加入50 mL糖蜜乙醇废水，利用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分别调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10后接入种子液，接着在28 ℃、80 r/min摇床中振荡培养，得到菌株发酵液，测定菌株发酵液、发酵培养基的吸光度，计算絮凝率。
1.2.4.2 正交试验 设计接种量、絮凝时间、温度、初始pH值等4个因素的3个水平，考察影响絮凝率的条件，以得出絮凝菌的最佳絮凝条件，因素水平设计见表1。
1.2.5 处理糖蜜乙醇废水 在最佳絮凝条件下，用絮凝菌对糖蜜乙醇废水进行处理，比较处理前后水质的参数变化，衡量水质参数的指标为COD、色度和浊度。
采用COD测定计（型号：A-7325）测量COD，采用浊度仪 （型号：BTCJ-TSS）测量浊度，利用色度计（HI93727色度比色计）测定色度。
2 结果与分析
2.1 絮凝剂产生菌的选择
从宜州博庆公司怀远糖厂的废水污泥中经初筛、复筛分离纯化得到1株具有高絮凝活性的菌株，其絮凝率为92%，因此选择该菌株用于后续试验。
2.2 絮凝剂产生菌的鉴定
菌种形态学观察及ITS序列的测序鉴定：在固体培养基上于28 ℃培养2 d，可见白色菌丝，3 d开始产生孢子，5 d时孢子成熟。菌落直径约为3 cm，正面干燥蓬松，呈灰棕色（图1-a）;孢子呈圆形、灰色（图1-b）。结合ITS测序结果（ITS片段长度为760 bp，图2），初步判断WSZ03菌株属于曲霉属。
2.3 SWZ03的絮凝率曲线
于稀释10倍的糖蜜乙醇废液培养基中接入1%絮凝菌孢子悬液，不同培养时间段对糖蜜乙醇废液的絮凝效果见图3。可以得出，该菌培养在48 h时达到较高的絮凝活性，通过测定菌体湿质量可知，此时菌体的生物量也已经达到最高水平。因此，后续试验均采用培养48 h的菌液作为菌种。
2.4 接种量对WSZ03絮凝效果的影响
采用“1.2.4.1”节中的试验方法，考察接种量、培养时间、培养温度和初始pH值等4个因素对絮凝菌絮凝效果的影响。由图4至图7的单因素絮凝试验结果表明，接种量对絮凝活性的影响不大，当接种量为2%时，絮凝效果明显;当培养时间为36 h时，絮凝率较高;培养温度对絮凝活性的影响亦不明显，31 ℃时的絮凝率较高;当初始pH值为6时，絮凝率较高。
2.5 絮凝条件的正交试验
按照“1.2.4.2”节的试验方法对以上影响絮凝效果的4个因素做4因素3水平正交试验。由表2可知，4个因素极差从小到大的顺序为时间