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摘要 随着科学技术的迅猛发展，现代生物学技术已经发展到后基因组时代，蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。二维差异凝胶电泳（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）技术是在双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，是分析和鉴定基因功能的强有力工具，比经典的2-DE技术具有更高的动力学范围和灵敏性。该文就2D-DIGE技术的发展以及在昆虫研究上的应用前景进行了展望。
关键词 二维差异凝胶电泳；蛋白质组学；昆虫
中图分类号 Q968.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）10-0014-04
1 研究背景
随着大量生物体全基因组序列的揭示，特别是人类基因组测序计划的完成，标志着生命科学研究取得了极其重要的阶段性成果，同时也标志着生命科学正式进入崭新的后基因组时代[1-2]，研究的重心也从揭示遗传信息结构的基因组学转移到功能基因组学上来，蛋白质组学作为高通量的蛋白质分析方法，也将对功能基因的研究做出巨大贡献。蛋白质作为基因表达的产物与生命活动的执行者，直接体现了生命现象的复杂性和多变性。因此，只有对实现最终功能的蛋白质进行分析鉴定，才能更好地描述细胞活动或行使功能的动力学过程，才能更贴近对生命现象和本质的掌握。二维差异凝胶电泳（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）技术是分析和鉴定昆虫基因功能的强有力工具，其是在双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，在生物学各个领域得到广泛的应用[3-6]。2D-DIGE在昆虫免疫调节、生理发育、昆虫毒理学以及传毒媒介昆虫的传毒机制等领域的应用也变得越来越广泛，其研究结果受到科学家们的高度重视。该文就二维差异凝胶电泳技术的发展以及在昆虫学研究中的应用进行探讨。
2 二维差异凝胶电泳技术的发展
2.1 蛋白质组与蛋白质组学
蛋白质组（proteome）一词由澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams于1994年在意大利的一次科学会议上首次提出，指在特定的生理和病理条件下一个基因组或一个细胞、组织表达的全部蛋白质[7]。蛋白质组学（proteomics）是后基因组时代产生的一门新兴学科，是以蛋白质组为研究对象，大规模、系统地研究蛋白质的特征及结构，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白质组成分的动态变化、蛋白质间的相互作用和相互联系等，旨在从整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律[8]。蛋白质组学是分子研究的终点，也是对生物体性状的最直接反映，同时也是目前研究最多、成果较丰富的学科。
2.2 双向凝胶电泳技术
近年来，蛋白质组学技术已经日趋成熟和完善，并被广泛应用于生命科学的各个领域，在昆虫学研究中也得到了广泛应用。自从1975年 O’’Farrell[9]和Klose等人建立双向凝胶电泳技术（2-DE）以来，2-DE技术凭借其高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配等优点成为目前蛋白质组学研究的核心手段。2-DE技术是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异性，通过2次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术。第一向电泳依据蛋白质等电点的不同，通过等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）将带有不同净电荷的蛋白质进行分离。第二向十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是依据蛋白质分子质量的不同将蛋白质与SDS形成复合物后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进一步分离。由于2-DE技术在样品制备、电泳条件和凝胶染色等条件上无法完全一致而产生胶间差异，使试验重复性差，敏感度低，甚至可能掩盖样品间真正的生物学差异或产生假阳性[5]。此外，膜蛋白样品溶解性、低丰度蛋白质检测、极酸极碱性蛋白质降解、电泳图谱的分析、低分子量和高分子量蛋白质分离等也是制约2-DE技术应用和发展的瓶颈。
2.3 二维差异凝胶电泳技术
为了解决2-DE技术存在的缺陷，Unlü et al[10]提出了荧光二维差异凝胶电泳技术（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。2D-DIGE技术是目前蛋白质组学研究中可信度、敏感度和准确率最高的技术之一，该分析系统是建立在传统的双向电泳技术的基础上，在双向电泳前先对蛋白样品进行荧光（如Cy2，Cy3，Cy5）标记，然后把标记好的蛋白质样品进行混合，同时在一块凝胶上进行电泳。2D-DIGE技术结合了多重荧光分析的方法，在同一块凝胶上能同时分离出多个分别由不同荧光标记的蛋白质样品，并第一次引入了内标（internal standard）的概念，更好地消除了试验的偶然误差，避免了不同凝胶之间的差异，极大地提高了结果的准确性和可信度[11]。在2D-DIGE技术中，每个蛋白质点都有相应的内标，软件自动根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，从而克服了不同凝胶间电泳造成的蛋白质点位置和量的差异，这样可以很好地去除蛋白质样品的假阳性差异点[12]。另外，2D-DIGE技术不需要进行电泳后的固定或脱色过程，可以减少蛋白质特别是低分子量蛋白质的损失[13]。
2D-DIGE技术的原理是先用不同的荧光染料标记蛋白质样品，再使蛋白质变性，然后用固定pH梯度凝胶，根据蛋白质电荷差异分离出不同pH值的蛋白质带，再将此胶条置于含SDS的聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质分子量加以分离，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的SDS-PAGE凝胶图像[14]。其主要步骤：用2种不同的荧光染料花青（Cy2、Cy3或Cy5）标记要比较的蛋白质样品；等量均匀混合荧光标记后的样品；使用相同的内标，将混合后的样品经双向凝胶电泳进行分离；在荧光显微镜下，用不同的激发波长来检测电泳结果[15]。2D-DIGE技术可以全面地观察到2种样品蛋白质表达间的差异，避免了不同凝胶之间的差异对结果分析带来的影响，保证了试验条件的一致性，有利于差异蛋白质表达点的筛选。同时采用不同波长的扫描，通过观察一个蛋白质点2种荧光密度的深浅或有无，可以获得有关特定蛋白质点丰度的变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质出现等信息。 3 二维差异凝胶电泳技术在昆虫学研究中的应用
3.1 在昆虫发育生物学上的应用
果蝇（Drosophila）因具有染色体数目少、染色体大、有多对易于区分的相对性状、繁殖快、易饲养等特点，成为发育生物学研究中非常重要的模式生物。果蝇腹沟的形成是原肠胚时期一个非常关键的形态发生事件，能引起中胚层前体细胞的分化。虽然基因组学已经揭示了参与腹沟形成的相关基因，但是担当腹沟细胞生命活动载体的结构蛋白还没有被鉴定出来。通过采用2D-DIGE技术，Gong et al[16]对果蝇胚胎的腹面与两侧胚胎进行了分析比较，鉴定出超过50个蛋白质在表达量或是亚型上发生了变化。研究发现，这些有差异的蛋白质大多数在原肠胚形成之前表现良好，只有少数随着原肠胚的形成及其表达量发生改变，表明腹部细胞是细胞形变的根本，而且还在果蝇胚胎的腹部和侧面发现了3种蛋白酶体亚基的差异。采用核糖核酸干扰敲击这些蛋白酶体亚基以及和时间相关差异蛋白质，可造成腹沟缺陷，从而确认腹沟形态发生时期这些蛋白质承担着重要作用。对胚胎发育过程中蛋白质变化的分析，为从分子水平上阐明果蝇胚胎发育的机制提供了切入点。
3.2 在昆虫毒理学上的应用
谷蠹（Rhyzopertha dominica）是一种世界性分布的储藏物蛀蚀性害虫，主要分布在热带、亚热带，危害远甚于米象（Sitophilus oryzae Linnaeus）、玉米象（Sitophilus zeamais）等其他蛀蚀性储藏物害虫。磷化氢（PH3）是一种广泛应用于储藏物害虫防治的熏蒸药剂，在谷蠹防治中起着极为重要的作用。但由于长期、大量地使用PH3，致使谷蠹对PH3产生了相当严重的抗性。20世纪70年代，在孟加拉国和澳大利亚等国家发现了谷蠹的磷化氢抗性品系[11]。Parket et al[17]曾采用2-DE技术对谷蠹成虫的磷化氢敏感品系和抗性品系进行蛋白质分离，用胰蛋白缩氨酸质谱分析法研究了不同品系间蛋白质位点的差异性，以此来鉴定它们物种的同源性，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了谷蠹敏感品系和抗性品系之间的蛋白质差异。研究结果显示，共有15个蛋白质点表达量下调，而6个蛋白质点只在磷化氢抗性品系中表达，其中精氨酸激酶的差异表达最为明显。因此，Parket认为敏感品系和抗性品系之间存在的差异可以用精氨酸激酶作为快速鉴别抗性的标记。但是Campbell[18]通过采用更加精确的2D-DIGE技术，对谷蠹成虫的敏感品系和抗性品系进行再次研究，分析精氨酸激酶作为测定谷蠹对PH3抗性指标的可能性。结果显示，在检测到的数百个蛋白质点中只有2个表现出明显的差异，同时精氨酸激酶也被鉴定出来，但其表达量变化并不显著，由此Campbell认为把精氨酸激酶作为研究谷蠹对PH3抗性机制的标记是不可靠的，并提出敏感品系与抗性品系的重要差异位点可能位于线粒体上。该研究为谷蠹抗性的检测与抗性发展预报提供了可靠方法，同时也为采取有效的防治策略提供了理论依据。
棉铃虫（Helicoverpa armigera）是一种重要的世界性农业害虫，也是严重威胁我国棉花生产的重要害虫[19]。转Bt基因棉是棉铃虫综合防治中一种有效的防治手段[20-21]，棉铃虫取食了转Bt基因棉以后，Bt毒素蛋白进入棉铃虫中肠，在消化道内消化酶的作用下，水解产生的活性毒素分子与中肠上皮细胞刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles，BBMV）上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔，消化道细胞的离子渗透压平衡遭到破坏，从而对棉铃虫产生毒性，最终导致其死亡[22]。随着Bt棉花的大面积种植，棉铃虫长期处于Bt毒蛋白的高压选择下，抗性问题不容忽视。高宇[23]通过采用2D-DIGE技术，比较了3个不同抗性品系与敏感品系棉铃虫中肠BBMV上特异性受体蛋白的差异，并对差异蛋白质点进行了鉴定分析。研究结果表明，在3个抗性品系中共获得77个具有统计学意义的差异蛋白质点，其中50个蛋白质点表达量上调，27个蛋白质点表达量下调，并通过生物质谱技术对选取的13个差异蛋白质点进行鉴定，成功鉴定出7个差异蛋白质点。该研究为Bt毒素作用机理的研究以及控制棉铃虫对Bt毒素抗性的发展提供了理论依据。
利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的晶体毒素（crystalline toxin，Cry）培育转基因作物所引起的昆虫抗药性，一直是被关注的焦点。生物标记有助于改进DNA鉴定技术，可以更好地监测昆虫在自然种群下对Bt Cry毒素的抗性发展。Jurat-Fuentes et al[24]把中肠膜结合碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）在蛋白质组学和基因组监测表达水平的降低作为共同的监测标准，对Cry毒素有抗性的烟青虫（Helicoverpa assulta Guenee）幼虫、棉铃虫幼虫和草地夜蛾（Spdoptera frugiperda）幼虫与敏感品系的幼虫进行比较分析。通过采用2D-DIGE技术来检测Cry毒素抗性品系和敏感品系幼虫膜结合碱性磷酸酯酶表达量，结果发现抗性烟青虫幼虫膜结合碱性磷酸酯酶表达量降低，并且进一步被碱性磷酸酯酶活跃度监测和蛋白免疫印迹等方法所验证。随后通过定时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术证明抗性烟青虫幼虫膜结合碱性磷酸酶蛋白水平的下降，是由于整体转录产物水平下降引起的。苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素必须与中肠刷状薄膜内特殊受体结合才能表现出毒性，大多数报道认为对Cry1Ac毒素产生抗性的机制是源于这些受体的改变。通过采用多肽聚合指纹识别技术或从头测序技术鉴定出薄膜中碱性磷酸酶和一种特别的磷酸酶是Cry1Ac结合蛋白，并确定Cry1Ac结合蛋白为二维结构。Jurat-Fuentes et al[25]采用2D-DIGE技术把3个独立的烟青虫抗性品系与1个烟青虫敏感品系幼虫用Cry1Ac毒素处理，然后对比分析处理后的烟青虫幼虫中肠内刷毛状薄膜Cry1Ac的结合蛋白。研究结果表明，碱性磷酸酶表达量水平的降低与YHD2-B品系烟青虫幼虫抵抗Cry1Ac毒素有密切的关系。同时，确切地证明了碱性磷酸酶是一种Cry1Ac结合蛋白和特殊受体。YHD2-B品系烟青虫幼虫抵抗Cry1Ac毒素与碱性磷酸酶的表达量紧密相关，这也意味着碱性磷酸酶可作为潜在的抗性标记物。相同的，在毒蛋白Cry1Ac抗性种群棉铃虫和Cry1Fa抗性野生突变种群草地夜蛾体内，也检测到碱性磷酸酯酶活跃度和膜结合碱性磷酸酯酶水平的下降。这些研究结果定向地支持了采用2D-DIGE技术的生物标记法可有效地检测鳞翅目害虫对Cry毒素的抗性发展，同时为开发新的有效杀虫剂提供理论依据。 3.3 在昆虫免疫学上的应用
果蝇是研究昆虫天然免疫力的重要模式生物，为研究昆虫天然免疫力与人类天然免疫力的相关性架起了桥梁。通过采用2D-DIGE技术，Vierstraete et al[26]对比分析了被革兰氏阴性细菌藤黄微球菌及酵母菌感染的果蝇3龄幼虫和对照组幼虫血淋巴蛋白质组的变化。研究结果表明，被革兰氏阴性藤黄球菌和酵母菌感染的果蝇3龄幼虫，其血淋巴中分别有20个和19个蛋白质点表达量上调。运用生物质谱鉴定技术对表达量有差异的蛋白质进行鉴定，发现多数差异点为同一蛋白质，表明存在翻译后修饰过程。这些有差异性的蛋白质，大多数对一种病菌有特殊的调节作用，但是当应对一些刺激时，如脂多糖类的刺激，只有相当少数的蛋白质发生改变。在未被感染的果蝇幼虫血淋巴中蛋白质表达量没有增加，因而蛋白质表达量的增加与免疫系统的特殊作用有密切关系。随后，之前未被标识的免疫蛋白也被鉴定出来，如CG4306蛋白质，并确定了它的同系物在多细胞动物基因组数据库中所具备的功能。
3.4 在传毒媒介昆虫上的应用
昆虫往往是某些微生物的寄主和传播病毒病的媒介，利用蛋白质组学研究寄主昆虫与病原物间相互关系，可为植物病害治理及人畜疾病预防与治疗提供理论基础[27]。尽管越来越多的证据表明病原体对被感染寄主有行为操纵的作用，但大多数情况下，被感染寄主在利于病原体传播的潜在机制中所扮演的角色还是未知的。冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）作为恶性疟原虫的寄主，是目前研究最多的媒介昆虫，Lefevre et al[28]采用2D-DIGE技术对被疟疾感染的冈比亚按蚊和未被感染的冈比亚按蚊的头部蛋白质组进行了分离分析。结果表明，被感染的蚊子头部有12个蛋白质发生差异性表达，质谱鉴定显示这些差异蛋白质主要与代谢、信号传导、分子伴侣及细胞骨架相关。这些差异蛋白质的发现揭示了其行为修饰的内在分子机制，也为疟原虫与冈比亚按蚊相互作用的研究提供了新的方法。
昆虫所携带的传染病病毒引起了很多新型的、感染能力强的传染病。在这些虫媒病毒中，登革热病毒和曲屈公病毒是在全世界范围内引起人类疾病的重要病毒。蚊子的中肠是防止病菌感染的第一道障碍，同时也是虫媒病毒在感染其他组织器官之前必须要复制的靶标器官。Tchankouo-Nguetcheu et al[29]采用2D-DIGE技术研究病毒与被感染媒介昆虫的相互关系以及被感染媒介昆虫中肠蛋白质组的变化。结果发现埃及伊蚊（Aedes aegypti）通过口器感染7DPI的登革热Ⅱ型病毒和曲屈公病毒7d后，其中肠蛋白质表达量发生了明显变化，凝胶成像对比显示，登革热Ⅱ型病毒引起了18个蛋白质点差异性变化，曲屈公病毒引起12个蛋白质点差异性变化，这2种病毒以相同或不同的方式引起20个相同蛋白质点发生差异表达。登革热Ⅱ型病毒和曲屈公病毒感染造成了相同世代的埃及伊蚊中肠内与氧化反应、能量代谢、糖类和脂质新陈代谢相关蛋白质量的增加。此外，曲屈公病毒引起了一系列与解毒密切相关蛋白质量的增加。研究还发现，被病毒感染后所发生差异性表达的蛋白质主要包括结构蛋白、调节蛋白以及与氧化还原作用和新陈代谢相关的酶类，在这些蛋白质中，有些蛋白质与细胞对抗氧化剂的防卫有密切关系；而一些调节蛋白例如铁传递蛋白、热休克蛋白60和麦芽糖酶，可能对病毒的生存、复制、传播有利，这也就意味着虫媒病毒对昆虫细胞的新陈代谢会产生破坏。这一研究是对埃及伊蚊被不同种类的病毒感染后中肠蛋白质差异性表达的首次研究。
登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒很可能是造成多种传染病的最初传染源，但是目前支持这种假设的报道很少。Patramool et al[30]运用2D-DIGE技术，分析白纹伊蚊（Aedes albopictus）被登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒感染期间细胞系蛋白质差异性表达。通过大量观察研究，白纹伊蚊在被登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒感染48 h后，与细胞应激反应和糖酵解过程相关的蛋白质发生了超表达。病毒性感染激活了某些寄主基因的翻译过程，很可能会给未激活蛋白质的回应带来压力，白纹伊蚊体内的氧化还原和糖酵解生化过程也参与抵抗登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒反应机制中。该研究在细胞水平阐明了登革热病毒—蚊子相互作用的机制，并且对制订有效的控制登革热病毒策略有重大意义。
3.5 在昆虫与寄主植物相互作用上的应用
番茄植株被马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）取食后，植株生长矮小，产量下降，并且会造成植株顶梢枯死，叶片畸形坏死，甚至导致植株死亡[31]。抗虫番茄植株中的Mi-1.2基因对无致病力马铃薯长管蚜的无性繁殖个体具有抗性。无致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上的存活率很低，然而有致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上有很高的存活率。Francis et al[32]通过采用2D-DIGE技术与质谱检测相结合的技术，对比分析了无致病力和有致病力的马铃薯长管蚜及其细菌内共生体在抗病和感病番茄寄主上蛋白质组的改变。结果表明，在4组试验中共鉴定出82个蛋白质点发生差异性表达，其中48个蛋白质点鉴定为同一类，有致病力和无致病力的马铃薯长管蚜相比，其体内与新陈代谢紧密相关的结构蛋白和酶类更加丰富。当把有致病力的马铃薯长管蚜从感病寄主转移到抗性寄主上时，其体内一些蛋白质表达量会上调，在这些差异性表达的蛋白质中，接近1/4的蛋白质发源于马铃薯长管蚜内共生体而不是其本身，同时鉴定出6个表达量上调的蛋白质发源于原始的蚜虫内共生菌，5个表达量上调的蛋白质很可能起源于第2代立克次氏体内共生菌。该研究证明了有致病力和无致病力马铃薯长管蚜体内的细菌内共生体蛋白质表达量也存在很大差异，但它们都受到寄主植物的影响，因此认为，细菌内共生体对马铃薯长管蚜适应抗性寄主有一定的帮助作用。
4 展望
2D-DIGE技术的引入与创新为昆虫蛋白质组学的研究分析提供了新方法，也是蛋白质差异表达技术真正意义上的变革。2D-DIGE技术凭借敏感度高、重复性好、宽动力学范围等优势，更加适用于多种因素的复杂试验设计和为蛋白质翻译后加工修饰提供相关信息。目前，2D-DIGE技术已广泛应用于医学[33]、微生物[34]、植物[3]、昆虫等差异蛋白质研究领域，并取得了很大的成绩，极大地推动了蛋白质组学的发展。但是在进行蛋白质差异表达研究时，2D-DIGE技术也存在其自身的局限性，如荧光染料只能标记在赖氨酸残基上，无法标记或无法检测到不含赖氨酸的蛋白质；低丰度、疏水性、极端酸性或碱性的蛋白质难以检测。此外，染色、扫描设备的高昂成本和多个蛋白质点在凝胶中同一位置重叠也是限制其应用发展的难题。随着科学技术的不断发展，蛋白质组学研究技术将得到不断革新和完善，制约2D-DIGE技术发展的瓶颈问题也将迎刃而解。相信2D-DIGE蛋白质定量分析技术将极大地促进蛋白质组学研究进展，并与其他蛋白质组技术相互整合和互补，为生命科学研究提供一个强有力的工具。 5 参考文献
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关键词 二维差异凝胶电泳；蛋白质组学；昆虫
中图分类号 Q968.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）10-0014-04
1 研究背景
随着大量生物体全基因组序列的揭示，特别是人类基因组测序计划的完成，标志着生命科学研究取得了极其重要的阶段性成果，同时也标志着生命科学正式进入崭新的后基因组时代[1-2]，研究的重心也从揭示遗传信息结构的基因组学转移到功能基因组学上来，蛋白质组学作为高通量的蛋白质分析方法，也将对功能基因的研究做出巨大贡献。蛋白质作为基因表达的产物与生命活动的执行者，直接体现了生命现象的复杂性和多变性。因此，只有对实现最终功能的蛋白质进行分析鉴定，才能更好地描述细胞活动或行使功能的动力学过程，才能更贴近对生命现象和本质的掌握。二维差异凝胶电泳（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）技术是分析和鉴定昆虫基因功能的强有力工具，其是在双向凝胶电泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，在生物学各个领域得到广泛的应用[3-6]。2D-DIGE在昆虫免疫调节、生理发育、昆虫毒理学以及传毒媒介昆虫的传毒机制等领域的应用也变得越来越广泛，其研究结果受到科学家们的高度重视。该文就二维差异凝胶电泳技术的发展以及在昆虫学研究中的应用进行探讨。
2 二维差异凝胶电泳技术的发展
2.1 蛋白质组与蛋白质组学
蛋白质组（proteome）一词由澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams于1994年在意大利的一次科学会议上首次提出，指在特定的生理和病理条件下一个基因组或一个细胞、组织表达的全部蛋白质[7]。蛋白质组学（proteomics）是后基因组时代产生的一门新兴学科，是以蛋白质组为研究对象，大规模、系统地研究蛋白质的特征及结构，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白质组成分的动态变化、蛋白质间的相互作用和相互联系等，旨在从整体水平上阐明生命现象的本质和活动规律[8]。蛋白质组学是分子研究的终点，也是对生物体性状的最直接反映，同时也是目前研究最多、成果较丰富的学科。
2.2 双向凝胶电泳技术
近年来，蛋白质组学技术已经日趋成熟和完善，并被广泛应用于生命科学的各个领域，在昆虫学研究中也得到了广泛应用。自从1975年 O’’Farrell[9]和Klose等人建立双向凝胶电泳技术（2-DE）以来，2-DE技术凭借其高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配等优点成为目前蛋白质组学研究的核心手段。2-DE技术是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异性，通过2次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术。第一向电泳依据蛋白质等电点的不同，通过等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）将带有不同净电荷的蛋白质进行分离。第二向十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是依据蛋白质分子质量的不同将蛋白质与SDS形成复合物后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进一步分离。由于2-DE技术在样品制备、电泳条件和凝胶染色等条件上无法完全一致而产生胶间差异，使试验重复性差，敏感度低，甚至可能掩盖样品间真正的生物学差异或产生假阳性[5]。此外，膜蛋白样品溶解性、低丰度蛋白质检测、极酸极碱性蛋白质降解、电泳图谱的分析、低分子量和高分子量蛋白质分离等也是制约2-DE技术应用和发展的瓶颈。
2.3 二维差异凝胶电泳技术
为了解决2-DE技术存在的缺陷，Unlü et al[10]提出了荧光二维差异凝胶电泳技术（Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。2D-DIGE技术是目前蛋白质组学研究中可信度、敏感度和准确率最高的技术之一，该分析系统是建立在传统的双向电泳技术的基础上，在双向电泳前先对蛋白样品进行荧光（如Cy2，Cy3，Cy5）标记，然后把标记好的蛋白质样品进行混合，同时在一块凝胶上进行电泳。2D-DIGE技术结合了多重荧光分析的方法，在同一块凝胶上能同时分离出多个分别由不同荧光标记的蛋白质样品，并第一次引入了内标（internal standard）的概念，更好地消除了试验的偶然误差，避免了不同凝胶之间的差异，极大地提高了结果的准确性和可信度[11]。在2D-DIGE技术中，每个蛋白质点都有相应的内标，软件自动根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，从而克服了不同凝胶间电泳造成的蛋白质点位置和量的差异，这样可以很好地去除蛋白质样品的假阳性差异点[12]。另外，2D-DIGE技术不需要进行电泳后的固定或脱色过程，可以减少蛋白质特别是低分子量蛋白质的损失[13]。
2D-DIGE技术的原理是先用不同的荧光染料标记蛋白质样品，再使蛋白质变性，然后用固定pH梯度凝胶，根据蛋白质电荷差异分离出不同pH值的蛋白质带，再将此胶条置于含SDS的聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质分子量加以分离，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的SDS-PAGE凝胶图像[14]。其主要步骤：用2种不同的荧光染料花青（Cy2、Cy3或Cy5）标记要比较的蛋白质样品；等量均匀混合荧光标记后的样品；使用相同的内标，将混合后的样品经双向凝胶电泳进行分离；在荧光显微镜下，用不同的激发波长来检测电泳结果[15]。2D-DIGE技术可以全面地观察到2种样品蛋白质表达间的差异，避免了不同凝胶之间的差异对结果分析带来的影响，保证了试验条件的一致性，有利于差异蛋白质表达点的筛选。同时采用不同波长的扫描，通过观察一个蛋白质点2种荧光密度的深浅或有无，可以获得有关特定蛋白质点丰度的变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质出现等信息。 3 二维差异凝胶电泳技术在昆虫学研究中的应用
3.1 在昆虫发育生物学上的应用
果蝇（Drosophila）因具有染色体数目少、染色体大、有多对易于区分的相对性状、繁殖快、易饲养等特点，成为发育生物学研究中非常重要的模式生物。果蝇腹沟的形成是原肠胚时期一个非常关键的形态发生事件，能引起中胚层前体细胞的分化。虽然基因组学已经揭示了参与腹沟形成的相关基因，但是担当腹沟细胞生命活动载体的结构蛋白还没有被鉴定出来。通过采用2D-DIGE技术，Gong et al[16]对果蝇胚胎的腹面与两侧胚胎进行了分析比较，鉴定出超过50个蛋白质在表达量或是亚型上发生了变化。研究发现，这些有差异的蛋白质大多数在原肠胚形成之前表现良好，只有少数随着原肠胚的形成及其表达量发生改变，表明腹部细胞是细胞形变的根本，而且还在果蝇胚胎的腹部和侧面发现了3种蛋白酶体亚基的差异。采用核糖核酸干扰敲击这些蛋白酶体亚基以及和时间相关差异蛋白质，可造成腹沟缺陷，从而确认腹沟形态发生时期这些蛋白质承担着重要作用。对胚胎发育过程中蛋白质变化的分析，为从分子水平上阐明果蝇胚胎发育的机制提供了切入点。
3.2 在昆虫毒理学上的应用
谷蠹（Rhyzopertha dominica）是一种世界性分布的储藏物蛀蚀性害虫，主要分布在热带、亚热带，危害远甚于米象（Sitophilus oryzae Linnaeus）、玉米象（Sitophilus zeamais）等其他蛀蚀性储藏物害虫。磷化氢（PH3）是一种广泛应用于储藏物害虫防治的熏蒸药剂，在谷蠹防治中起着极为重要的作用。但由于长期、大量地使用PH3，致使谷蠹对PH3产生了相当严重的抗性。20世纪70年代，在孟加拉国和澳大利亚等国家发现了谷蠹的磷化氢抗性品系[11]。Parket et al[17]曾采用2-DE技术对谷蠹成虫的磷化氢敏感品系和抗性品系进行蛋白质分离，用胰蛋白缩氨酸质谱分析法研究了不同品系间蛋白质位点的差异性，以此来鉴定它们物种的同源性，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳比较了谷蠹敏感品系和抗性品系之间的蛋白质差异。研究结果显示，共有15个蛋白质点表达量下调，而6个蛋白质点只在磷化氢抗性品系中表达，其中精氨酸激酶的差异表达最为明显。因此，Parket认为敏感品系和抗性品系之间存在的差异可以用精氨酸激酶作为快速鉴别抗性的标记。但是Campbell[18]通过采用更加精确的2D-DIGE技术，对谷蠹成虫的敏感品系和抗性品系进行再次研究，分析精氨酸激酶作为测定谷蠹对PH3抗性指标的可能性。结果显示，在检测到的数百个蛋白质点中只有2个表现出明显的差异，同时精氨酸激酶也被鉴定出来，但其表达量变化并不显著，由此Campbell认为把精氨酸激酶作为研究谷蠹对PH3抗性机制的标记是不可靠的，并提出敏感品系与抗性品系的重要差异位点可能位于线粒体上。该研究为谷蠹抗性的检测与抗性发展预报提供了可靠方法，同时也为采取有效的防治策略提供了理论依据。
棉铃虫（Helicoverpa armigera）是一种重要的世界性农业害虫，也是严重威胁我国棉花生产的重要害虫[19]。转Bt基因棉是棉铃虫综合防治中一种有效的防治手段[20-21]，棉铃虫取食了转Bt基因棉以后，Bt毒素蛋白进入棉铃虫中肠，在消化道内消化酶的作用下，水解产生的活性毒素分子与中肠上皮细胞刷状缘膜囊（brush border membrane vesicles，BBMV）上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜穿孔，消化道细胞的离子渗透压平衡遭到破坏，从而对棉铃虫产生毒性，最终导致其死亡[22]。随着Bt棉花的大面积种植，棉铃虫长期处于Bt毒蛋白的高压选择下，抗性问题不容忽视。高宇[23]通过采用2D-DIGE技术，比较了3个不同抗性品系与敏感品系棉铃虫中肠BBMV上特异性受体蛋白的差异，并对差异蛋白质点进行了鉴定分析。研究结果表明，在3个抗性品系中共获得77个具有统计学意义的差异蛋白质点，其中50个蛋白质点表达量上调，27个蛋白质点表达量下调，并通过生物质谱技术对选取的13个差异蛋白质点进行鉴定，成功鉴定出7个差异蛋白质点。该研究为Bt毒素作用机理的研究以及控制棉铃虫对Bt毒素抗性的发展提供了理论依据。
利用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的晶体毒素（crystalline toxin，Cry）培育转基因作物所引起的昆虫抗药性，一直是被关注的焦点。生物标记有助于改进DNA鉴定技术，可以更好地监测昆虫在自然种群下对Bt Cry毒素的抗性发展。Jurat-Fuentes et al[24]把中肠膜结合碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）在蛋白质组学和基因组监测表达水平的降低作为共同的监测标准，对Cry毒素有抗性的烟青虫（Helicoverpa assulta Guenee）幼虫、棉铃虫幼虫和草地夜蛾（Spdoptera frugiperda）幼虫与敏感品系的幼虫进行比较分析。通过采用2D-DIGE技术来检测Cry毒素抗性品系和敏感品系幼虫膜结合碱性磷酸酯酶表达量，结果发现抗性烟青虫幼虫膜结合碱性磷酸酯酶表达量降低，并且进一步被碱性磷酸酯酶活跃度监测和蛋白免疫印迹等方法所验证。随后通过定时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术证明抗性烟青虫幼虫膜结合碱性磷酸酶蛋白水平的下降，是由于整体转录产物水平下降引起的。苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素必须与中肠刷状薄膜内特殊受体结合才能表现出毒性，大多数报道认为对Cry1Ac毒素产生抗性的机制是源于这些受体的改变。通过采用多肽聚合指纹识别技术或从头测序技术鉴定出薄膜中碱性磷酸酶和一种特别的磷酸酶是Cry1Ac结合蛋白，并确定Cry1Ac结合蛋白为二维结构。Jurat-Fuentes et al[25]采用2D-DIGE技术把3个独立的烟青虫抗性品系与1个烟青虫敏感品系幼虫用Cry1Ac毒素处理，然后对比分析处理后的烟青虫幼虫中肠内刷毛状薄膜Cry1Ac的结合蛋白。研究结果表明，碱性磷酸酶表达量水平的降低与YHD2-B品系烟青虫幼虫抵抗Cry1Ac毒素有密切的关系。同时，确切地证明了碱性磷酸酶是一种Cry1Ac结合蛋白和特殊受体。YHD2-B品系烟青虫幼虫抵抗Cry1Ac毒素与碱性磷酸酶的表达量紧密相关，这也意味着碱性磷酸酶可作为潜在的抗性标记物。相同的，在毒蛋白Cry1Ac抗性种群棉铃虫和Cry1Fa抗性野生突变种群草地夜蛾体内，也检测到碱性磷酸酯酶活跃度和膜结合碱性磷酸酯酶水平的下降。这些研究结果定向地支持了采用2D-DIGE技术的生物标记法可有效地检测鳞翅目害虫对Cry毒素的抗性发展，同时为开发新的有效杀虫剂提供理论依据。 3.3 在昆虫免疫学上的应用
果蝇是研究昆虫天然免疫力的重要模式生物，为研究昆虫天然免疫力与人类天然免疫力的相关性架起了桥梁。通过采用2D-DIGE技术，Vierstraete et al[26]对比分析了被革兰氏阴性细菌藤黄微球菌及酵母菌感染的果蝇3龄幼虫和对照组幼虫血淋巴蛋白质组的变化。研究结果表明，被革兰氏阴性藤黄球菌和酵母菌感染的果蝇3龄幼虫，其血淋巴中分别有20个和19个蛋白质点表达量上调。运用生物质谱鉴定技术对表达量有差异的蛋白质进行鉴定，发现多数差异点为同一蛋白质，表明存在翻译后修饰过程。这些有差异性的蛋白质，大多数对一种病菌有特殊的调节作用，但是当应对一些刺激时，如脂多糖类的刺激，只有相当少数的蛋白质发生改变。在未被感染的果蝇幼虫血淋巴中蛋白质表达量没有增加，因而蛋白质表达量的增加与免疫系统的特殊作用有密切关系。随后，之前未被标识的免疫蛋白也被鉴定出来，如CG4306蛋白质，并确定了它的同系物在多细胞动物基因组数据库中所具备的功能。
3.4 在传毒媒介昆虫上的应用
昆虫往往是某些微生物的寄主和传播病毒病的媒介，利用蛋白质组学研究寄主昆虫与病原物间相互关系，可为植物病害治理及人畜疾病预防与治疗提供理论基础[27]。尽管越来越多的证据表明病原体对被感染寄主有行为操纵的作用，但大多数情况下，被感染寄主在利于病原体传播的潜在机制中所扮演的角色还是未知的。冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）作为恶性疟原虫的寄主，是目前研究最多的媒介昆虫，Lefevre et al[28]采用2D-DIGE技术对被疟疾感染的冈比亚按蚊和未被感染的冈比亚按蚊的头部蛋白质组进行了分离分析。结果表明，被感染的蚊子头部有12个蛋白质发生差异性表达，质谱鉴定显示这些差异蛋白质主要与代谢、信号传导、分子伴侣及细胞骨架相关。这些差异蛋白质的发现揭示了其行为修饰的内在分子机制，也为疟原虫与冈比亚按蚊相互作用的研究提供了新的方法。
昆虫所携带的传染病病毒引起了很多新型的、感染能力强的传染病。在这些虫媒病毒中，登革热病毒和曲屈公病毒是在全世界范围内引起人类疾病的重要病毒。蚊子的中肠是防止病菌感染的第一道障碍，同时也是虫媒病毒在感染其他组织器官之前必须要复制的靶标器官。Tchankouo-Nguetcheu et al[29]采用2D-DIGE技术研究病毒与被感染媒介昆虫的相互关系以及被感染媒介昆虫中肠蛋白质组的变化。结果发现埃及伊蚊（Aedes aegypti）通过口器感染7DPI的登革热Ⅱ型病毒和曲屈公病毒7d后，其中肠蛋白质表达量发生了明显变化，凝胶成像对比显示，登革热Ⅱ型病毒引起了18个蛋白质点差异性变化，曲屈公病毒引起12个蛋白质点差异性变化，这2种病毒以相同或不同的方式引起20个相同蛋白质点发生差异表达。登革热Ⅱ型病毒和曲屈公病毒感染造成了相同世代的埃及伊蚊中肠内与氧化反应、能量代谢、糖类和脂质新陈代谢相关蛋白质量的增加。此外，曲屈公病毒引起了一系列与解毒密切相关蛋白质量的增加。研究还发现，被病毒感染后所发生差异性表达的蛋白质主要包括结构蛋白、调节蛋白以及与氧化还原作用和新陈代谢相关的酶类，在这些蛋白质中，有些蛋白质与细胞对抗氧化剂的防卫有密切关系；而一些调节蛋白例如铁传递蛋白、热休克蛋白60和麦芽糖酶，可能对病毒的生存、复制、传播有利，这也就意味着虫媒病毒对昆虫细胞的新陈代谢会产生破坏。这一研究是对埃及伊蚊被不同种类的病毒感染后中肠蛋白质差异性表达的首次研究。
登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒很可能是造成多种传染病的最初传染源，但是目前支持这种假设的报道很少。Patramool et al[30]运用2D-DIGE技术，分析白纹伊蚊（Aedes albopictus）被登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒感染期间细胞系蛋白质差异性表达。通过大量观察研究，白纹伊蚊在被登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒感染48 h后，与细胞应激反应和糖酵解过程相关的蛋白质发生了超表达。病毒性感染激活了某些寄主基因的翻译过程，很可能会给未激活蛋白质的回应带来压力，白纹伊蚊体内的氧化还原和糖酵解生化过程也参与抵抗登革热Ⅰ型和Ⅲ型病毒反应机制中。该研究在细胞水平阐明了登革热病毒—蚊子相互作用的机制，并且对制订有效的控制登革热病毒策略有重大意义。
3.5 在昆虫与寄主植物相互作用上的应用
番茄植株被马铃薯长管蚜（Macrosiphum euphorbiae）取食后，植株生长矮小，产量下降，并且会造成植株顶梢枯死，叶片畸形坏死，甚至导致植株死亡[31]。抗虫番茄植株中的Mi-1.2基因对无致病力马铃薯长管蚜的无性繁殖个体具有抗性。无致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上的存活率很低，然而有致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上有很高的存活率。Francis et al[32]通过采用2D-DIGE技术与质谱检测相结合的技术，对比分析了无致病力和有致病力的马铃薯长管蚜及其细菌内共生体在抗病和感病番茄寄主上蛋白质组的改变。结果表明，在4组试验中共鉴定出82个蛋白质点发生差异性表达，其中48个蛋白质点鉴定为同一类，有致病力和无致病力的马铃薯长管蚜相比，其体内与新陈代谢紧密相关的结构蛋白和酶类更加丰富。当把有致病力的马铃薯长管蚜从感病寄主转移到抗性寄主上时，其体内一些蛋白质表达量会上调，在这些差异性表达的蛋白质中，接近1/4的蛋白质发源于马铃薯长管蚜内共生体而不是其本身，同时鉴定出6个表达量上调的蛋白质发源于原始的蚜虫内共生菌，5个表达量上调的蛋白质很可能起源于第2代立克次氏体内共生菌。该研究证明了有致病力和无致病力马铃薯长管蚜体内的细菌内共生体蛋白质表达量也存在很大差异，但它们都受到寄主植物的影响，因此认为，细菌内共生体对马铃薯长管蚜适应抗性寄主有一定的帮助作用。
4 展望
2D-DIGE技术的引入与创新为昆虫蛋白质组学的研究分析提供了新方法，也是蛋白质差异表达技术真正意义上的变革。2D-DIGE技术凭借敏感度高、重复性好、宽动力学范围等优势，更加适用于多种因素的复杂试验设计和为蛋白质翻译后加工修饰提供相关信息。目前，2D-DIGE技术已广泛应用于医学[33]、微生物[34]、植物[3]、昆虫等差异蛋白质研究领域，并取得了很大的成绩，极大地推动了蛋白质组学的发展。但是在进行蛋白质差异表达研究时，2D-DIGE技术也存在其自身的局限性，如荧光染料只能标记在赖氨酸残基上，无法标记或无法检测到不含赖氨酸的蛋白质；低丰度、疏水性、极端酸性或碱性的蛋白质难以检测。此外，染色、扫描设备的高昂成本和多个蛋白质点在凝胶中同一位置重叠也是限制其应用发展的难题。随着科学技术的不断发展，蛋白质组学研究技术将得到不断革新和完善，制约2D-DIGE技术发展的瓶颈问题也将迎刃而解。相信2D-DIGE蛋白质定量分析技术将极大地促进蛋白质组学研究进展，并与其他蛋白质组技术相互整合和互补，为生命科学研究提供一个强有力的工具。 5 参考文献
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