【摘 要】
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应用定向进化技术提高了猪肾氨基酰化酶I(pACY1)对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的底物特异性和热稳定性.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了pACY1的突变体文库;利用营养选
【机 构】
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湖北工业大学生物工程学院,湖北武汉 430068
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应用定向进化技术提高了猪肾氨基酰化酶I(pACY1)对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的底物特异性和热稳定性.结合易错PCR和DNA改组的方法,构建了pACY1的突变体文库;利用营养选择平板和96孔板耐热双重筛选体系.经过5轮改组和筛选,得到突变酶7E15对乙酰-L-精氨酸和乙酰-L-苯丙氨酸的特异性活力分别提高了23倍和9倍,Tm 值提高了7℃.突变酶的氨基酸序列中有7个氨基酸残基发生了替换,分别是 L176A、R196T、A283G、V304G、K306Q、V369A和L370T.结构模拟结果显示,突变位点L176A、V369A和L370T靠近酶活性中心,影响了底物的结合;而R196T、A283G、V304G和K306Q离酶活性中心较远,可能对酶的热稳定性起到了关键作用.
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