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摘要 為明确不同侵染时期对小麦赤霉病发生和籽粒中DON的积累情况，在2015年和2016年于河南省焦作市温县黄庄镇西虢村田间进行小麦（‘豫保1号’和 ‘周麦18’）不同生育期接种对病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON毒素积累的影响试验。结果表明：小麦赤霉病菌在抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）至灌浆中期（DAA=14或15，Zadoks=75）都能侵染麦穗，但在始花期前3～4 d的齐穗期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）至始花期后4 d的灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）处理的病穗率、病情指数和病粒率显著高于其他处理（P<0.05），其中盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）处理的侵染率最高，为小麦赤霉病菌侵染发病的关键生育期。此外，在套袋保湿2 d的条件下赤霉病菌在小麦始花期前6 d的抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）和始花期后10 d的乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）也能有较高的侵染率。在籽粒中DON积累方面，‘豫保1号’所有处理的籽粒中DON含量与病穗率、病情指数和病粒率的趋势一致，都是盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）处理的籽粒中DON含量最高（P<0.05），且间隔时间离盛花末期（Zadoks=69）越近籽粒中DON含量越高；而‘周麦18’齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）至灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的没有显著性差异，说明小麦赤霉病菌在始花期后14 d的灌浆中期侵染也能引起籽粒中DON的大量积累。
关键词 小麦； 赤霉病； 侵染时期； 脱氧雪腐镰刀菌烯醇
中图分类号： S 435.121.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017472
Abstract In order to clarify the effect of the different inoculation timing on Fusarium head blight （FHB） and mycotoxin accumulation in wheat， field experiments were conducted in Wen County of Henan Province in 2015 and 2016. Treatments consisted of different inoculation timings， including early heading stage （DAA=-6，Zadoks=55-57）， heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59）， heading stage （DAA=-1 or -2，Zadoks=59）， early anthesis stage （DAA=0，Zadoks=61）， late anthesis stage （DAA=1，Zadoks=67-69）， early filling stage （DAA=4，Zadoks=71）， milking stage （DAA=9 or 10，Zadoks=73） and mid-filling stage （DAA=14 or 15，Zadoks=75）. The results indicated thatFusarium graminearum could infect wheat head during early heading stage （DAA=-6，Zadoks=55-57） to mid-filling stage （DAA=14 or 15，Zadoks=75）. The FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels from the heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59） to early filling stage （DAA=4，Zadoks=71） were significant higher than the other treatment （P<0.05）.
Among them， the highest infection rate was at the late anthesis stage （DAA=1， Zadoks=69）， which was the key stage of infection. In addition， the infection rate ofF.graminearumwas also higher at early heading stage （DAA=-6， Zadoks=55-57） and the milking stage （DAA=9 or 10； Zadoks=73） under humid condition. The closer time from late anthesis stage （DAA=1 or 3，Zadoks=69） was， the higher FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels were. The trend of the DON content was consistent with the FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels from the heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59） to early filling stage （DAA=4，Zadoks=71） in ‘Yubao 1’， but there was no significant difference in DON content during heading stage （DAA=-4，Zadoks=59） to mid-filling stage （DAA=14，Zadoks=75） in ‘Zhoumai 18’. Therefore， the infection ofFusarium graminearum during the middle and late filling stage of wheat cultivar ‘Zhoumai 18’ could also cause the great accumulation of DON in grains. Key words wheat； Fusarium head blight； timing of inoculation； deoxynivalenol
小麦赤霉病是小麦上的重要病害，它不仅对小麦产量造成损失，而且病籽粒中还带有脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒素，对人畜健康造成严重危害[1-5]。小麦籽粒中毒素浓度超标不仅在我国存在，在世界各国小麦种植区都有报道[3-5]。
为了有效控制小麦赤霉病的发生发展和籽粒中DON的积累，明确小麦赤霉病菌的侵染时期非常重要。多项研究表明，小麦抽穗扬花期是小麦赤霉病菌最易侵染麦穗的时期[6]，同时也是小麦赤霉病防治的关键时期[7-11]。但小麦赤霉病菌在小麦花期前后侵染情况如何以及籽粒中DON的积累情况如何鲜有报道。作者用室内培养的小麦赤霉病菌孢子悬浮液在小麦抽穗期、始花期、盛花末期、灌浆初期和乳熟期等不同生育期进行喷雾接种，调查赤霉病最终病情，测定籽粒中DON毒素积累情况，旨在明确小麦赤霉病菌侵染和小麦籽粒DON积累的关键生育期，为小麦赤霉病的防治时期提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试小麦品种
供试小麦品种为‘豫保1号’和‘周麦18’，均为小麦赤霉病的感病品种，其中‘豫保1号’为河南省农业科学院植物保护研究所选育的半冬性品种，亲本为‘豫麦2号’/‘周8826’；‘周麦18’为河南省周口农业科学院选育的半冬性品种，也是河南省小麦品种区试的对照品种，親本为‘内乡185’/‘周麦9号’。两个品种均由河南省农业科学院植物保护研究所保存和提供。
1.2 田间试验设计
试验地点在河南省焦作市温县黄庄镇西虢村（经度：112.959 4°，纬度：34.980 2°，海拔：112.8 m）。2015年于10月8日播种，2016年6月5日收获，供试小麦品种为‘周麦18’；2016年于10月10日播种，2017年6月6日收获，试验小麦品种为‘豫保1号’和‘周麦18’。每个处理小区宽2 m，长6 m，行距20 cm，随机区组排列，每个处理3次重复，播种量为135～150 kg/hm.2，按常规措施进行田间管理，使用除草剂和杀虫剂，但不使用杀菌剂。
1.3 接种物的培养与田间接种
试验菌株为5株毒素化学型均为15ADON的禾谷镰刀菌Fusarium graminearum，分别为14LY9-2-4、14AY1-2、14YY1-3、14KF3-8、14ZK1-4。将-80℃冻存的禾谷镰刀菌菌株在新鲜的PDA平板上活化，25℃黑暗条件下培养3 d，打取10块直径5 mm边缘菌丝块转接到150 mL的羧甲基纤维素酯液体培养基（CMC）中，置于恒温摇床上，25℃ 150 r/min 摇培5 d，每个菌株10瓶（150 mL CMC/250 mL三角瓶）。分别将供试菌株的分生孢子悬浮液用双重纱布过滤，用血球计数板计数，记录各菌株分生孢子悬浮液浓度并置于-20℃的冰箱保存。田间喷雾接种前将各菌株等孢子量混合，用水调至分生孢子浓度为5×10.4个/mL[13-14]。
接种处理时期根据与扬花初期相距的天数（days after anthesis，DAA）和生育期（Zadoks）[12]分别标注。接种处理时期包括：抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）、齐穗期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）、齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）、盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）、灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）、乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）共8个时期。在相应的接种时期，使用手持式小型气压式喷雾器，将禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液（浓度为5×10.4个/mL），按50 mL/m.2进行均匀喷雾。接种时间选择在下午4：00以后，接种前先喷水保湿，用水量为750 L/ hm.2。每个小区接种后选取4点，每点10穗，共40穗，用塑料袋套袋保湿，2 d后去掉塑料袋，并用红色绳子系住作为标记。小麦蜡熟期前（扬花后21 d）调查病情，自然条件下（接种后没有套袋保湿处理）选取3点，每点框出0.667 m.2的样方，调查记载框内的病穗数和病级；套袋保湿的处理每个小区选取40个穗，也同样记录病穗数和病级[15]。病级记载标准为：0级，无发病小穗；1级，零星小穗发病，发病小穗数占总小穗数的25.0%以下；2级，发病小穗占总小穗数的25.0%～50.0%；3级，发病小穗占总小穗数的50.1%～75.0%； 4级，发病小穗占总小穗数的75.0%以上。病穗率和病情指数计算方法如下：
病穗率=病穗数总穗数×100%；
病情指数=∑（各病级穗数×病级数）总穗数×4×100。
小麦成熟后（DAA=40），每个小区取3个样方（每个样方为0.667 m.2），使用小型脱粒机脱粒，晾干后分别装在网袋中并称量；每袋中取两个500粒麦粒分别称量，调查病粒数，计算病粒率；每袋样本取出粉碎，然后称取粉碎后的样本5 g装入50 mL离心管中进行DON测定。每个小区麦粒样品粉碎后，严格清理以避免相互污染，最后放入4℃冰箱中保存。
将5 g样品粉末加入50 mL离心管中，再加入25 mL蒸馏水，用力振荡3 min，并使用Whatman No.1滤纸过滤，收集滤液，然后稀释10、100、1 000和10 000倍备用。使用RIDASCREEN.DON酶联免疫法呕吐毒素定量检测（R5906）试剂盒检测样品中DON毒素，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行[13-14]。标准样品浓度为0、3.7、11.1、33.3、100 μg/L。在酶标仪上同时测定标准样品和待测样品450 nm处的吸光度值，每个样品重复测定3次。当滤液中DON毒素浓度过高或者过低而超出检测范围时，使用其不同倍数的稀释液。使用R-Biopharm德国拜发应用软件RIDA.SOFT Win（Z9999）进行结果评估。并按照单次检测的Logit/log曲线进行分析，然后计算3次检测结果的平均值。 2 结果与分析
2.1 2015年自然条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
2015年试验中，小麦品种‘周麦18’6个接种时期的生育期分别是，4月22日为齐穗期（DAA=-2，Zadoks=59），4月24日为始花期（DAA=0，Zadoks=61），4月26日为盛花末期（DAA=2，Zadoks=68），4月28日为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=10，Zadoks=73），5月9日为灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）。4月22日-6月6日的平均温度为23℃，降雨量为15.6 mm，分布在灌浆中期。自然条件下田间试验调查结果表明，齐穗期（DAA=-2，Zadoks=59），始花期（DAA=0，Zadoks=61），盛花末期（DAA=2，Zadoks=68），灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）处理的病穗率分别为69.2%，84.8%，80.4%和90.7%，病情指数分别为24.5，34.1，29.3，30.8，它们的病穗率间和病情指数间没有显著差异（P>0.05）。乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）处理的病穗率分别为16.7%和9.6%，病情指数分别为4.4和2.6，它们的病穗率和病情指数显著低于其他生育期处理的病穗率和病情指数（P<0.05）（图1）。
2.2 2016年自然条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量的影响
2016年试验中，‘周麦18’在8个接种时期的生育期分别是，4月18日处于抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55），4月21日处于齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59），4月24日仍处于齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59），4月25日为始花期（DAA=0，Zadoks=61），4月26日为盛花期（DAA=1，Zadoks=67），4月28日为灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=9，Zadoks=73），5月9日为灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）。4月18日-6月6日的平均温度为22℃，降雨量为53.9 mm，分布在灌浆中期和收获期。自然条件下田间试验调查结果表明，齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病穗率较高，分别为35.1%，31.7%和31.3%，且相互之间没有显著性差异（P>0.05）；齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）处理的病穗率次之，为14.6%；抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55），乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病穗率显著低于其他处理的病穗率（P<0.05）（图2e）。在病情指数方面，灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）>始花期（DAA=0，Zadoks=61）>扬花前1天的齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）和盛花期（DAA=1，Zadoks=67）>扬花前4天的齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）>灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75），抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）和乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）（图2e）。收获后籽粒取样室内检测结果表明，‘周麦18’ 盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病粒率最高，为18.8%，与始花期（DAA=0，Zadoks=61）和灌漿初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病粒率没有显著性差异，但显著高于其他处理的病粒率（P<0.05）。扬花前4 d的齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）、扬花前1 d的齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病粒率之间没有显著性差异（P>0.05），分别为8.8%，11.6%，11.1%和8.1%。抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）处理的病粒率最低为4.5%。在籽粒中DON含量上，所有处理的籽粒中DON含量在7.5 ～22.5 mg/kg之间。除抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）外，其他处理的籽粒中DON含量没有显著性差异（P>0.05）（图2f）。
2.3 2016年保湿条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
‘周麦18’接种后套袋保湿2 d的条件下田间试验调查结果表明，各个处理的病穗率和病情指数都比自然条件下高，病穗率为13.8%～88.8%，病情指数为3.8～64.7（图2d）。齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）和盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病穗率较高，分别为75.0%，88.8%，87.5%，它们之间没有显著性差异；齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病穗率次之；再次为扬花前6 d的抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）和乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）处理的病穗率；灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病穗率最低。在病情指数上，盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病情指数最高，为64.7，与始花期（DAA=0，Zadoks=61）处理的病情指数没有显著性差异，但显著高于其他处理的病情指数。齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病情指数分别为44.7和47.2，它们之间没有显著性差异。抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）、乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病情指数较低，分别为17.8，10.0和3.8。 2.4 2016年自然条件下‘豫保1号’不同生育期接种对赤霉病病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量的影响
2016年试验，4月18日‘豫保1号’处于抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57），4月21日仍处于齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59），4月24日上午开始扬花，下午已经进入盛花末期（DAA=0，Zadoks=68），4月25日为盛花末期（DAA=1，Zadoks=69），4月28日为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=10，Zadoks=73），5月9日仍在灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）。4月18日-6月6日的平均温度为22℃，降雨量为53.9 mm，分布在灌浆中期和收获期。自然条件下田间试验调查结果表明，各处理的病穗率在4.6%～56.1%之间，病情指数在2.1～33.6之间，病粒率在5.1%～23.4%之间，籽粒中DON含量在4.1 ～20.5 mg/kg（图2b和2c）。盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）处理的病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量最高，分别为56.1%，33.6，23.4%和20.5 mg/kg，显著高于其他处理（P<0.05）（图2b和2c）；盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）处理次之；再次为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）和齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）处理；抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57），乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）处理的病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量较低，显著低于其他处理的病穗率，病情指数，病粒率和籽粒中DON含量（P<0.05）。
2.5 2016年保湿条件下‘豫保1号’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
‘豫保1号’接种后套袋保湿2 d的条件下调查结果表明，各个处理的病穗率和病情指数都比自然条件下高，病穗率为2.5%～98.8%，病情指数为06～83.4（图2a）。盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）的病穗率和病情指数最高，分别为98.8%和83.4，显著高于其他处理的病穗率和病情指数（P<0.05）；盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）和齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）处理次之，病穗率分别为86.3%和77.5%；再次为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）和抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57）处理，病穗率分别为61.3%和67.5%；乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）處理的病穗率和病情指数较低，显著低于其他处理的病穗率和病情指数（P<0.05），但乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）处理病穗率仍然能达到28.8%。
3 讨论
本文试验结果表明小麦从抽穗盛期（Zadoks=55）到灌浆中期（Zadoks=75）都可以被小麦赤霉病菌侵染，盛花末期（Zadoks=69）为小麦赤霉病最易感的时期。此结果在前人研究[2， 6， 16-17]和本研究中都再次得到证实。2016年对‘豫保1号’的接种处理，在自然条件下和套袋保湿条件下均为盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）接种的病穗率、病情指数最高，自然条件下盛花末期接种的病粒率和籽粒中的DON含量也为最高。
本研究发现始花期前3～4 d的齐穗期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）至始花期后3～4 d的灌浆初期（DAA=3或4，Zadoks=71）为小麦赤霉病菌侵染发病的关键阶段。本研究中小麦赤霉病菌侵染的关键时期与商鸿生等[8]研究中小麦赤霉病关键防治时期为齐穗期至扬花后5 d的时期基本吻合。除上述关键阶段外，本研究还发现在套袋保湿2 d的条件下小麦赤霉病菌在小麦抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）和乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）有较高的侵染率（2016年‘豫保1号’的病穗率>25%，2016年‘周麦18’的病穗率>30%），虽然在自然条件下这两个时期它们的病穗率和病情指数都不高（2016年‘豫保1号’的病穗率<20%，2016年‘周麦18’的病穗率<10%）。此结论与吴佳文等[18]在江苏省田间观察的灌浆期条件合适时也能造成小麦赤霉病的暴发的结论一致。
在病粒率和籽粒中DON积累方面，两个品种的结果不一样，但趋势一致。一致的是抽穗盛期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）至灌浆初期（DAA=3或4，Zadoks=71）侵染后的病粒率和籽粒中DON积累较高，且间隔时间离盛花末期越近数值越高。不一致的是在籽粒中DON积累上结果不一样。不同小麦品种DON毒素积累不一样的原因可能是寄主产生降解DON毒素酶的能力不同。在2016年的‘豫保1号’自然条件下盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）>盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）>齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）（P<0.05）；但是2016年‘周麦18’自然条件下的籽粒中DON含量在除抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）外所有时期都没有显著性差异。因此小麦赤霉病菌在‘周麦18’乳熟期到灌浆中期侵染也能引起籽粒中DON的大量积累。本结论与Yoshida和Nakajima[19]的研究中灌浆中期虽然没有明显的赤霉病症状，但籽粒中DON毒素大量积累的结论吻合。
另外，籽粒中DON含量与病粒率呈显著正相关，与前人结果相同[13-14]。2016年‘豫保1号’自然条件下籽粒中DON含量与病粒率、病情指数和病穗率呈极显著正相关，其相关系数分别为r=0.97（P<0.01），r=0.94（P<0.01），r=0.90（P<0.01）（表1）。2016年‘周麦18’自然条件下籽粒中DON含量与病粒率呈显著正相关，其相关系数为r=0.73（P<0.05）。因此，可以通过统计病粒率来反映籽粒中DON含量的情况。 参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
关键词 小麦； 赤霉病； 侵染时期； 脱氧雪腐镰刀菌烯醇
中图分类号： S 435.121.45
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2017472
Abstract In order to clarify the effect of the different inoculation timing on Fusarium head blight （FHB） and mycotoxin accumulation in wheat， field experiments were conducted in Wen County of Henan Province in 2015 and 2016. Treatments consisted of different inoculation timings， including early heading stage （DAA=-6，Zadoks=55-57）， heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59）， heading stage （DAA=-1 or -2，Zadoks=59）， early anthesis stage （DAA=0，Zadoks=61）， late anthesis stage （DAA=1，Zadoks=67-69）， early filling stage （DAA=4，Zadoks=71）， milking stage （DAA=9 or 10，Zadoks=73） and mid-filling stage （DAA=14 or 15，Zadoks=75）. The results indicated thatFusarium graminearum could infect wheat head during early heading stage （DAA=-6，Zadoks=55-57） to mid-filling stage （DAA=14 or 15，Zadoks=75）. The FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels from the heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59） to early filling stage （DAA=4，Zadoks=71） were significant higher than the other treatment （P<0.05）.
Among them， the highest infection rate was at the late anthesis stage （DAA=1， Zadoks=69）， which was the key stage of infection. In addition， the infection rate ofF.graminearumwas also higher at early heading stage （DAA=-6， Zadoks=55-57） and the milking stage （DAA=9 or 10； Zadoks=73） under humid condition. The closer time from late anthesis stage （DAA=1 or 3，Zadoks=69） was， the higher FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels were. The trend of the DON content was consistent with the FHB incidence， FHB disease index and percentage of Fusarium-damaged kernels from the heading stage （DAA=-3 or -4，Zadoks=59） to early filling stage （DAA=4，Zadoks=71） in ‘Yubao 1’， but there was no significant difference in DON content during heading stage （DAA=-4，Zadoks=59） to mid-filling stage （DAA=14，Zadoks=75） in ‘Zhoumai 18’. Therefore， the infection ofFusarium graminearum during the middle and late filling stage of wheat cultivar ‘Zhoumai 18’ could also cause the great accumulation of DON in grains. Key words wheat； Fusarium head blight； timing of inoculation； deoxynivalenol
小麦赤霉病是小麦上的重要病害，它不仅对小麦产量造成损失，而且病籽粒中还带有脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒素，对人畜健康造成严重危害[1-5]。小麦籽粒中毒素浓度超标不仅在我国存在，在世界各国小麦种植区都有报道[3-5]。
为了有效控制小麦赤霉病的发生发展和籽粒中DON的积累，明确小麦赤霉病菌的侵染时期非常重要。多项研究表明，小麦抽穗扬花期是小麦赤霉病菌最易侵染麦穗的时期[6]，同时也是小麦赤霉病防治的关键时期[7-11]。但小麦赤霉病菌在小麦花期前后侵染情况如何以及籽粒中DON的积累情况如何鲜有报道。作者用室内培养的小麦赤霉病菌孢子悬浮液在小麦抽穗期、始花期、盛花末期、灌浆初期和乳熟期等不同生育期进行喷雾接种，调查赤霉病最终病情，测定籽粒中DON毒素积累情况，旨在明确小麦赤霉病菌侵染和小麦籽粒DON积累的关键生育期，为小麦赤霉病的防治时期提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试小麦品种
供试小麦品种为‘豫保1号’和‘周麦18’，均为小麦赤霉病的感病品种，其中‘豫保1号’为河南省农业科学院植物保护研究所选育的半冬性品种，亲本为‘豫麦2号’/‘周8826’；‘周麦18’为河南省周口农业科学院选育的半冬性品种，也是河南省小麦品种区试的对照品种，親本为‘内乡185’/‘周麦9号’。两个品种均由河南省农业科学院植物保护研究所保存和提供。
1.2 田间试验设计
试验地点在河南省焦作市温县黄庄镇西虢村（经度：112.959 4°，纬度：34.980 2°，海拔：112.8 m）。2015年于10月8日播种，2016年6月5日收获，供试小麦品种为‘周麦18’；2016年于10月10日播种，2017年6月6日收获，试验小麦品种为‘豫保1号’和‘周麦18’。每个处理小区宽2 m，长6 m，行距20 cm，随机区组排列，每个处理3次重复，播种量为135～150 kg/hm.2，按常规措施进行田间管理，使用除草剂和杀虫剂，但不使用杀菌剂。
1.3 接种物的培养与田间接种
试验菌株为5株毒素化学型均为15ADON的禾谷镰刀菌Fusarium graminearum，分别为14LY9-2-4、14AY1-2、14YY1-3、14KF3-8、14ZK1-4。将-80℃冻存的禾谷镰刀菌菌株在新鲜的PDA平板上活化，25℃黑暗条件下培养3 d，打取10块直径5 mm边缘菌丝块转接到150 mL的羧甲基纤维素酯液体培养基（CMC）中，置于恒温摇床上，25℃ 150 r/min 摇培5 d，每个菌株10瓶（150 mL CMC/250 mL三角瓶）。分别将供试菌株的分生孢子悬浮液用双重纱布过滤，用血球计数板计数，记录各菌株分生孢子悬浮液浓度并置于-20℃的冰箱保存。田间喷雾接种前将各菌株等孢子量混合，用水调至分生孢子浓度为5×10.4个/mL[13-14]。
接种处理时期根据与扬花初期相距的天数（days after anthesis，DAA）和生育期（Zadoks）[12]分别标注。接种处理时期包括：抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）、齐穗期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）、齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）、盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）、灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）、乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）共8个时期。在相应的接种时期，使用手持式小型气压式喷雾器，将禾谷镰刀菌分生孢子悬浮液（浓度为5×10.4个/mL），按50 mL/m.2进行均匀喷雾。接种时间选择在下午4：00以后，接种前先喷水保湿，用水量为750 L/ hm.2。每个小区接种后选取4点，每点10穗，共40穗，用塑料袋套袋保湿，2 d后去掉塑料袋，并用红色绳子系住作为标记。小麦蜡熟期前（扬花后21 d）调查病情，自然条件下（接种后没有套袋保湿处理）选取3点，每点框出0.667 m.2的样方，调查记载框内的病穗数和病级；套袋保湿的处理每个小区选取40个穗，也同样记录病穗数和病级[15]。病级记载标准为：0级，无发病小穗；1级，零星小穗发病，发病小穗数占总小穗数的25.0%以下；2级，发病小穗占总小穗数的25.0%～50.0%；3级，发病小穗占总小穗数的50.1%～75.0%； 4级，发病小穗占总小穗数的75.0%以上。病穗率和病情指数计算方法如下：
病穗率=病穗数总穗数×100%；
病情指数=∑（各病级穗数×病级数）总穗数×4×100。
小麦成熟后（DAA=40），每个小区取3个样方（每个样方为0.667 m.2），使用小型脱粒机脱粒，晾干后分别装在网袋中并称量；每袋中取两个500粒麦粒分别称量，调查病粒数，计算病粒率；每袋样本取出粉碎，然后称取粉碎后的样本5 g装入50 mL离心管中进行DON测定。每个小区麦粒样品粉碎后，严格清理以避免相互污染，最后放入4℃冰箱中保存。
将5 g样品粉末加入50 mL离心管中，再加入25 mL蒸馏水，用力振荡3 min，并使用Whatman No.1滤纸过滤，收集滤液，然后稀释10、100、1 000和10 000倍备用。使用RIDASCREEN.DON酶联免疫法呕吐毒素定量检测（R5906）试剂盒检测样品中DON毒素，操作步骤按照ELISA试剂盒说明书进行[13-14]。标准样品浓度为0、3.7、11.1、33.3、100 μg/L。在酶标仪上同时测定标准样品和待测样品450 nm处的吸光度值，每个样品重复测定3次。当滤液中DON毒素浓度过高或者过低而超出检测范围时，使用其不同倍数的稀释液。使用R-Biopharm德国拜发应用软件RIDA.SOFT Win（Z9999）进行结果评估。并按照单次检测的Logit/log曲线进行分析，然后计算3次检测结果的平均值。 2 结果与分析
2.1 2015年自然条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
2015年试验中，小麦品种‘周麦18’6个接种时期的生育期分别是，4月22日为齐穗期（DAA=-2，Zadoks=59），4月24日为始花期（DAA=0，Zadoks=61），4月26日为盛花末期（DAA=2，Zadoks=68），4月28日为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=10，Zadoks=73），5月9日为灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）。4月22日-6月6日的平均温度为23℃，降雨量为15.6 mm，分布在灌浆中期。自然条件下田间试验调查结果表明，齐穗期（DAA=-2，Zadoks=59），始花期（DAA=0，Zadoks=61），盛花末期（DAA=2，Zadoks=68），灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）处理的病穗率分别为69.2%，84.8%，80.4%和90.7%，病情指数分别为24.5，34.1，29.3，30.8，它们的病穗率间和病情指数间没有显著差异（P>0.05）。乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）处理的病穗率分别为16.7%和9.6%，病情指数分别为4.4和2.6，它们的病穗率和病情指数显著低于其他生育期处理的病穗率和病情指数（P<0.05）（图1）。
2.2 2016年自然条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量的影响
2016年试验中，‘周麦18’在8个接种时期的生育期分别是，4月18日处于抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55），4月21日处于齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59），4月24日仍处于齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59），4月25日为始花期（DAA=0，Zadoks=61），4月26日为盛花期（DAA=1，Zadoks=67），4月28日为灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=9，Zadoks=73），5月9日为灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）。4月18日-6月6日的平均温度为22℃，降雨量为53.9 mm，分布在灌浆中期和收获期。自然条件下田间试验调查结果表明，齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病穗率较高，分别为35.1%，31.7%和31.3%，且相互之间没有显著性差异（P>0.05）；齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）处理的病穗率次之，为14.6%；抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55），乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病穗率显著低于其他处理的病穗率（P<0.05）（图2e）。在病情指数方面，灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）>始花期（DAA=0，Zadoks=61）>扬花前1天的齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）和盛花期（DAA=1，Zadoks=67）>扬花前4天的齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）>灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75），抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）和乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）（图2e）。收获后籽粒取样室内检测结果表明，‘周麦18’ 盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病粒率最高，为18.8%，与始花期（DAA=0，Zadoks=61）和灌漿初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病粒率没有显著性差异，但显著高于其他处理的病粒率（P<0.05）。扬花前4 d的齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）、扬花前1 d的齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病粒率之间没有显著性差异（P>0.05），分别为8.8%，11.6%，11.1%和8.1%。抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）处理的病粒率最低为4.5%。在籽粒中DON含量上，所有处理的籽粒中DON含量在7.5 ～22.5 mg/kg之间。除抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）外，其他处理的籽粒中DON含量没有显著性差异（P>0.05）（图2f）。
2.3 2016年保湿条件下‘周麦18’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
‘周麦18’接种后套袋保湿2 d的条件下田间试验调查结果表明，各个处理的病穗率和病情指数都比自然条件下高，病穗率为13.8%～88.8%，病情指数为3.8～64.7（图2d）。齐穗期（DAA=-1，Zadoks=59）、始花期（DAA=0，Zadoks=61）和盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病穗率较高，分别为75.0%，88.8%，87.5%，它们之间没有显著性差异；齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病穗率次之；再次为扬花前6 d的抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）和乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）处理的病穗率；灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病穗率最低。在病情指数上，盛花期（DAA=1，Zadoks=67）处理的病情指数最高，为64.7，与始花期（DAA=0，Zadoks=61）处理的病情指数没有显著性差异，但显著高于其他处理的病情指数。齐穗期（DAA=-4，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=3，Zadoks=71）处理的病情指数分别为44.7和47.2，它们之间没有显著性差异。抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）、乳熟期（DAA=9，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=14，Zadoks=75）处理的病情指数较低，分别为17.8，10.0和3.8。 2.4 2016年自然条件下‘豫保1号’不同生育期接种对赤霉病病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量的影响
2016年试验，4月18日‘豫保1号’处于抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57），4月21日仍处于齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59），4月24日上午开始扬花，下午已经进入盛花末期（DAA=0，Zadoks=68），4月25日为盛花末期（DAA=1，Zadoks=69），4月28日为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71），5月4日进入乳熟期（DAA=10，Zadoks=73），5月9日仍在灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）。4月18日-6月6日的平均温度为22℃，降雨量为53.9 mm，分布在灌浆中期和收获期。自然条件下田间试验调查结果表明，各处理的病穗率在4.6%～56.1%之间，病情指数在2.1～33.6之间，病粒率在5.1%～23.4%之间，籽粒中DON含量在4.1 ～20.5 mg/kg（图2b和2c）。盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）处理的病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量最高，分别为56.1%，33.6，23.4%和20.5 mg/kg，显著高于其他处理（P<0.05）（图2b和2c）；盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）处理次之；再次为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）和齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）处理；抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57），乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）处理的病穗率、病情指数、病粒率和籽粒中DON含量较低，显著低于其他处理的病穗率，病情指数，病粒率和籽粒中DON含量（P<0.05）。
2.5 2016年保湿条件下‘豫保1号’ 不同生育期接种对赤霉病病穗率和病情指数的影响
‘豫保1号’接种后套袋保湿2 d的条件下调查结果表明，各个处理的病穗率和病情指数都比自然条件下高，病穗率为2.5%～98.8%，病情指数为06～83.4（图2a）。盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）的病穗率和病情指数最高，分别为98.8%和83.4，显著高于其他处理的病穗率和病情指数（P<0.05）；盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）和齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）处理次之，病穗率分别为86.3%和77.5%；再次为灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）和抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=57）处理，病穗率分别为61.3%和67.5%；乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）和灌浆中期（DAA=15，Zadoks=75）處理的病穗率和病情指数较低，显著低于其他处理的病穗率和病情指数（P<0.05），但乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）处理病穗率仍然能达到28.8%。
3 讨论
本文试验结果表明小麦从抽穗盛期（Zadoks=55）到灌浆中期（Zadoks=75）都可以被小麦赤霉病菌侵染，盛花末期（Zadoks=69）为小麦赤霉病最易感的时期。此结果在前人研究[2， 6， 16-17]和本研究中都再次得到证实。2016年对‘豫保1号’的接种处理，在自然条件下和套袋保湿条件下均为盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）接种的病穗率、病情指数最高，自然条件下盛花末期接种的病粒率和籽粒中的DON含量也为最高。
本研究发现始花期前3～4 d的齐穗期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）至始花期后3～4 d的灌浆初期（DAA=3或4，Zadoks=71）为小麦赤霉病菌侵染发病的关键阶段。本研究中小麦赤霉病菌侵染的关键时期与商鸿生等[8]研究中小麦赤霉病关键防治时期为齐穗期至扬花后5 d的时期基本吻合。除上述关键阶段外，本研究还发现在套袋保湿2 d的条件下小麦赤霉病菌在小麦抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55～57）和乳熟期（DAA=10，Zadoks=73）有较高的侵染率（2016年‘豫保1号’的病穗率>25%，2016年‘周麦18’的病穗率>30%），虽然在自然条件下这两个时期它们的病穗率和病情指数都不高（2016年‘豫保1号’的病穗率<20%，2016年‘周麦18’的病穗率<10%）。此结论与吴佳文等[18]在江苏省田间观察的灌浆期条件合适时也能造成小麦赤霉病的暴发的结论一致。
在病粒率和籽粒中DON积累方面，两个品种的结果不一样，但趋势一致。一致的是抽穗盛期（DAA=-3或-4，Zadoks=59）至灌浆初期（DAA=3或4，Zadoks=71）侵染后的病粒率和籽粒中DON积累较高，且间隔时间离盛花末期越近数值越高。不一致的是在籽粒中DON积累上结果不一样。不同小麦品种DON毒素积累不一样的原因可能是寄主产生降解DON毒素酶的能力不同。在2016年的‘豫保1号’自然条件下盛花末期（DAA=1，Zadoks=69）>盛花末期（DAA=0，Zadoks=68）>齐穗期（DAA=-3，Zadoks=59）和灌浆初期（DAA=4，Zadoks=71）（P<0.05）；但是2016年‘周麦18’自然条件下的籽粒中DON含量在除抽穗盛期（DAA=-6，Zadoks=55）外所有时期都没有显著性差异。因此小麦赤霉病菌在‘周麦18’乳熟期到灌浆中期侵染也能引起籽粒中DON的大量积累。本结论与Yoshida和Nakajima[19]的研究中灌浆中期虽然没有明显的赤霉病症状，但籽粒中DON毒素大量积累的结论吻合。
另外，籽粒中DON含量与病粒率呈显著正相关，与前人结果相同[13-14]。2016年‘豫保1号’自然条件下籽粒中DON含量与病粒率、病情指数和病穗率呈极显著正相关，其相关系数分别为r=0.97（P<0.01），r=0.94（P<0.01），r=0.90（P<0.01）（表1）。2016年‘周麦18’自然条件下籽粒中DON含量与病粒率呈显著正相关，其相关系数为r=0.73（P<0.05）。因此，可以通过统计病粒率来反映籽粒中DON含量的情况。 参考文献
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（责任编辑：杨明丽）